2024年1月21日发(作者：)

徐　海，鲍　熹，董洪燕，等．Ｔ７噬菌体穿孔素的克隆表达及对宿主损伤研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０２０，４８（２４）：４５－４９．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２０．２４．００８—４５—Ｔ７噬菌体穿孔素的克隆表达及对宿主损伤研究徐　海１，鲍　熹２，董洪燕１，郭长明１，邓碧华２，卢　宇２，朱善元１（１．江苏农牧科技职业学院／江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州２２５３００；２．江苏省农业科学院动物免疫工程研究所，江苏南京２１００１４）　　摘要：为研究Ｔ７噬菌体穿孔素（Ｈｏｌｉｎ）蛋白对宿主细菌的增殖性能的影响，根据Ｔ７噬菌体ｇｅｎｅ１７．５设计引物，ＰＣＲ扩增Ｈｏｌｉｎ基因和序列分析，将该基因插入原核表达载体构建重组表达菌ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ。ＩＰＴＧ诱导Ｈｏｌｉｎ蛋白表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测目标蛋白。分光光度法测定Ｈｏｌｉｎ蛋白对宿主细菌增殖性能的影响，扫描电镜观察重组菌诱导后表面结构的损伤情况。结果表明，成功扩增Ｈｏｌｉｎ基因，构建的重组菌能高效表达Ｈｏｌｉｎ蛋白。Ｔ７噬菌体Ｈｏｌｉｎ蛋白含有１个跨膜区，氨基端位于胞外、羧基端位于胞内。Ｈｏｌｉｎ蛋白的表达量随诱导时间延长而逐渐增至２ｈ逐渐升高，２ｈ后细菌浓度开始下降，直至６ｈ，电镜观察发现诱导细菌表面塌陷、皱缩进加，细菌浓度从诱导０ｈ而死亡。研究结果显示，Ｈｏｌｉｎ蛋白具有抑菌活性，这为进一步开发噬菌体抗菌制剂提供应用基础和技术支持。　　关键词：穿孔素；表达；宿主损伤；Ｔ７噬菌体　　中图分类号：Ｓ１８８　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０２０）２４－００４５－０４　　噬菌体是分子生物学起源与发展的模式生物，在发现之初就被用于细菌感染性疾病的治疗，随着人类进入抗生素时代使得噬菌体逐渐淡出人们的视野。近年来，细菌的耐药性已然成为全球范围内的公共健康问题，每年有近百万因耐药菌感染引起的死亡病例，面对这一严峻问题，人们开始寻找新的抗菌产品，这其中噬菌体作为细菌的天然杀手再１－２］次受到研究人员的关注［。然而，利用噬菌体防膜蛋白，在特定时间以寡聚体形式聚集于细胞内膜上并形成稳定的跨膜孔道，是噬菌体启动裂解步骤［１０－１２］。溶菌酶是一种胞质水解酶，随的“定时器”着孔道的打开，溶菌酶被释放到胞外，对肽聚糖层１３－１４］。近年来发现的Ｓｐａｎｉｎ蛋白进行高效的切割［对二元裂解模型做了进一步完善，该蛋白定位在细１５－１６］菌外膜，通过构象变化破坏细菌外膜结构［。在ｐａｎｉｎ的共同作用下，被侵染细溶菌酶、穿孔素和Ｓ菌彻底崩解。因此，研究上述３种蛋白与宿主细菌的作用关系，探明各自对宿主的损伤机制，才能更科学地加以利用。　　Ｔ７噬菌体是侵染大肠杆菌的小型烈性噬菌体，２ｈ即能完具有良好的生长性能，侵染宿主细菌１～全裂解。对Ｔ７噬菌体的生物学背景已有相对全面的研究，其全部基因序列己经测定，是噬菌体研究的理想模型。本研究通过原核系统表达Ｔ７噬菌体穿孔素蛋白，分析其结构特征，揭示该蛋白对宿主的损伤作用，并测定其抑菌活性，以期为新型抗菌制剂的开发提供有益探索。１　材料与方法１．１　试验材料质粒、菌株与噬菌体：质粒ｐＥＴ－２８ａ（＋）为笔者所在实验室保存。大肠杆菌ＢＬ２１－ＤＥ３、Ｔ７ｓｅｌｅｃｔ４１５－１ｂ噬菌体购自Ｍｅｒｃｋ公司。控细菌感染也面临一个棘手问题，噬菌体宿主识别谱窄，一种噬菌体往往只侵染一种或一类细菌，这３］限制了噬菌体在抗菌领域推广与应用［。烈性噬菌体裂解系统中的溶菌酶、穿孔素等蛋白作用于细菌的细胞壁、细胞膜，引起细菌裂解，效率高且不受宿主谱的限制，对细菌具有广谱的裂解活性，已成４－６］为开发新型抗菌制剂的热点之一［。　　烈性噬菌体裂解宿主细菌的过程有着紧密的７－９］调控、遵循着严格的时间顺序［。溶菌酶－穿孔素二元裂解模型的提出对这一过程给予系统的解析。穿孔素是控制裂解时间的小分子量疏水性跨收稿日期：２０２０－０４－１４基金项目：江苏农牧科技职业学院院级课题（编号：ＮＳＦ２０１９０２）。１９８２—），男，江苏扬州人，副研究员，主要从事兽作者简介：徐　海（用生物制品研发工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈａｉ＿ｘ＠１２６．ｃｏｍ。通信作者：朱善元，博士，教授，主要从事水禽疫病研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｓｔｚｚｓｙ＠１２６．ｃｏｍ。

—４６—　　主要试剂：限制性内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、反转录酶为大连宝生物公司产品；ＨＲＰ标记抗Ｈｉｓ标签二抗购自Ａｂｃｏｍ公司；引物由金斯瑞生物公司合成，引物序列为：Ｈｏｌｉｎ－Ｆ：５′－ＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＣＴＡＴＣＡＴＴＡＧＡＣＴ－３′，Ｈｏｌｉｎ－Ｒ：５′－ＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＴ－３′，引入中下划线分别表示限制酶切位点（ＮｃｏⅠ和ＢａｍＨ；其余试剂均为分析纯。Ⅰ）１．２　Ｈｏｌｉｎ基因分析曲线。１．６　Ｈｏｌｉｎ蛋白表达对宿主菌表面结构的影响以１∶１００比例转接过夜培养的ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ重组菌，在对数生长前期加入ＩＰＴＧ进行诱导，持续诱导３ｈ，同时设未诱导对照。５０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ收ＰＢＳ重悬洗涤１次，再次离心后收集沉集重组菌，淀，采用４％多聚甲醛固定。样品送至扬州大学检测中心，扫面电镜观察细菌表面结构。将Ｈｏｌｉｎ基因翻译成对应蛋白序列，利用在线分析工具ＴＭＨＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０）对其进行跨膜区预测；在Ｐｆａｍ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ）进行比对，分析Ｈｏｌｉｎ蛋白所属的家族；Ｐｒｏｔｐａｒａｍ工具（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）分析蛋白的理化性质；ＳＯＰＭＡ工具（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｐｓａ－ｐｒａｂｉ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）对蛋白质二级结构进行分析。１．３　重组菌构建以Ｔ７ｓｅｌｅｃｔ４１５－１ｂ噬菌体基因组为模板，ＰＣＲ扩增Ｈｏｌｉｎ基因。根据预设的酶切位点将基因片段插入原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－Ｈｏｌｉｎ，ＮｃｏⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切鉴定及测序分析。将序列正确的重组表达质粒化学转化导入大肠杆菌ＢＬ２１－ＤＥ３感受态细胞，筛选表达Ｈｏｌｉｎ蛋白的重组菌ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ。１．４　Ｈｏｌｉｎ蛋白诱导表达与鉴定挑取单菌落ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ接入含有１μｇ／ｍＬ卡那霉素的ＬＢ培养基中，３７℃摇床过夜培养。取５０μＬ过夜培养菌液至５ｍＬ新鲜卡那霉素抗性ＬＢ培养基中，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ摇床培养２ｈ，加入工作浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ进行诱导。同时，设ＢＬ２１和ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ未诱导对照。从诱导起始点开始，每隔２ｈ取样，经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测蛋白表达情况。转印蛋白至ＮＣ膜，用ＨＲＰ标记的羊抗Ｈｉｓｔａｇ二抗鉴定Ｈｏｌｉｎ蛋白。１．５　Ｈｏｌｉｎ蛋白表达对宿主菌增殖的影响以１∶１００比例转接过夜培养的ＢＬ２１、ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ至新鲜培养基，在对数生长前期往重组菌ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ中加入工作浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ进行诱导，同时设ＢＬ２１和未诱导对照组，于３７℃、２００ｒ／ｓ摇床持续培养。从转接起始点开始每隔１ｈ取２００μＬ培养液测定Ｄ６００ｎｍ，绘制３组细菌的生长２　结果２．１　Ｈｏｌｉｎ蛋白序列分析利用多种生物学软件对Ｔ７噬菌体Ｈｏｌｉｎ蛋白进行分析：Ｐｒｏｔｐａｒａｍ工具显示Ｔ７噬菌体Ｈｏｌｉｎ蛋白由６７个氨基酸组成，相对分子质量为７３５９，稳定系数为７．７１，总平均亲水性为０．４６４，为稳定、疏水性蛋白质。Ｐｆａｍ数据库比对结果表面Ｔ７噬菌体Ｈｏｌｉｎ蛋白属于Ｐｈａｇｅ＿ｈｏｌｉｎ＿２＿２家族（ＰＦ１０７４６）。ＴＭＨＭＭ软件分析表明其氨基酸端１～３６ａａ位于胞外区，３７～５５ａａ为跨膜区，５６～６７ａａ的羧基端为胞内区。ＳＯＰＭＡ工具显示，ｈｏｌｉｎ蛋白。α－螺旋、β－折叠、β－转角、延长链、和无规则卷曲分别占氨基酸总数的５６．７２％、０．００％、７．４６％、１０．４５％和２５３７％（图１）。２．２　Ｈｏｌｉｎ基因的克隆及重组质粒构建由图２－Ａ和２－Ｂ可知，以Ｔ７噬菌体基因为模板，ＰＣＲ扩增出约２５０ｂｐ的Ｈｏｌｉｎ基因，测序结果表明获得基因片段序列正确。将该基因片段插入ｐＥＴ－２８ａ（＋）载体，成功构建重组表达质粒载体ｐＥＴ－Ｈｏｌｉｎ，ＮｃｏⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切鉴定正确。２．３　Ｈｏｌｉｎ蛋白诱导表达及鉴定由图３－Ａ可知，对数生长前期的重组菌ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ经ＩＰＴＧ诱导后细菌浓度并未迅速上升，相反随着诱导时间的延长，重组菌出现裂解现象，培养

—４７—液变清亮且泡沫增多。由图３－Ｂ可知，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测诱导菌有蛋白表达。由图３－Ｃ可知，利用Ｈｏｌｉｎ蛋白羧基端融合表达的Ｈｉｓ标签进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，进一步确定诱导产生Ｈｏｌｉｎ蛋白，并且随着诱导时间的延长Ｈｏｌｉｎ蛋白的累积量逐渐增加。２．４　Ｈｏｌｉｎ蛋白的表达对宿主细菌增殖的影响ＩＰＴＧ诱导重组大肠杆菌ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ表达Ｈｏｌｉｎ蛋白，通过对重组表达菌不同时间点的浊度测定来评价Ｈｏｌｉｎ蛋白对宿主细菌增殖能力的影响，由图４可知，ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ转接后２ｈ开始诱导，细菌浊度缓慢上升至４ｈ，然后浊度逐渐下降，６～８ｈ浊度维持在较低水平，８ｈ后浊度开始缓慢上升。而未经诱导的ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ表现出与ＢＬ２１相似的增殖性能，表明Ｈｏｌｉｎ蛋白的表达抑制宿主的正常增殖。２．５　Ｈｏｌｉｎ蛋白对宿主细菌表面结构的损伤通过扫面电镜观察经ＩＰＴＧ诱导和未诱导的ＢＬ－Ｈｏｌｉｎ重组菌表面结构变化，评价Ｈｏｌｉｎ蛋白对宿主的损伤情况。由图５－Ｂ可知，诱导表达Ｈｏｌｉｎ蛋白的重组菌表面塌陷，菌体皱缩，而未诱导的重组菌保持完整的表面结构（图５－Ａ）。由此可知，重组菌表达Ｈｏｌｉｎ蛋白后造成胞膜的损伤，其结构完整性被破坏致使内容物释放到胞外，引起菌体死亡。３　讨论上世纪４０年代开始，噬菌体研究进入早期的黄金时代，以λ噬菌体和Ｔ４噬菌体作为模式生物的相关研究为现代分子生物学的建立作出了卓越贡献。Ｙｏｕｎｇ于１９９２年首次提出了著名的穿孔素－

—４８—参考文献：［１］ＡｂｅｄｏｎＳＴ．Ｕｓｅｏｆｐｈａｇｅｔｈｅｒａｐｙｔｏｔｒｅａｔｌｏｎｇ－ｓｔａｎｄｉｎｇ，ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ，ｏｒｃｈｒｏｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ，２０１９，１４５：１８－３９．［２］ＧｏｒｓｋｉＡ，ＭｉｅｄｚｙｂｒｏｄｚｋｉＲ，ＷｅｇｒｚｙｎＧ，ｅｔａｌ．Ｐｈａｇｅｔｈｅｒａｐｙ：ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗｓ，２０２０，４０：４５９－６３．［３］ＨｙｍａｎＰ．Ｐｈａｇｅｓｆｏｒｐｈａｇｅｔｈｅｒａｐｙ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｈｏｓｔｒａｎｇｅｂｒｅａｄｔｈ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０１９，１２（１）：３５．［４］ＢａａｓｅＷ，ＬｉｕＬ，ＴｒｏｎｒｕｄＤＥ，ｅｔａｌ．Ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍｔｈｅｌｙｓｏｚｙｍｅｏｆ溶菌酶二元裂解系统理论，清晰地阐明了λ噬菌体１７］。当然，这一理论将肽聚糖层的裂解宿主的过程［破坏作为裂解宿主菌的主要标志，却忽视了细菌外膜对裂解过程的阻碍。近年来，第三类裂解相关蛋白Ｓｐａｎｉｎ的发现进一步完善了该理论，至此λ噬菌Ｈｏｌｉｎ蛋白在细体裂解宿主的过程可分为３个步骤：菌内膜打孔，释放胞内溶菌酶切割肽聚糖层，Ｓｐａｎｉｎ通过构象变化撕裂细菌外膜，最终导致细菌的彻底崩解。参与这一过程的穿孔素、溶菌酶和Ｓｐａｎｉｎ均能造成细菌表面结构的损伤，因此被视为开发新型抗菌制剂的候选物质而备受关注。　　Ｔ７噬菌体裂解系统研究报道较少，现已明确溶菌酶（ｇｅｎｅ３．５）、穿孔素（ｇｅｎｅ１７．５）以及可能发挥Ｓｐａｎｉｎ功能的ｇｅｎｅ１８．５／１８．７构成了Ｔ７噬菌体裂解系统［１５，１８］。本研究对Ｔ７噬菌体Ｈｏｌｉｎ蛋白进行序列分析，发现该蛋白分子仅有１个跨膜区，属于Ｐｈａｇｅ＿ｈｏｌｉｎ＿２＿２家族（ＰＦ１０７４６），氨基酸端位于胞外，羧基端位于胞内，这与报道的Ｔ４、Ｔ５噬菌体的Ｈｏｌｉｎ蛋白拓扑结构相同。为了不影响Ｔ７噬菌体Ｈｏｌｉｎ蛋白的跨膜转运，选择位于胞内的羧基端融合表达Ｈｉｓ标签用于Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测。结合图３－Ｃ和图４，重组菌诱导后２ｈ内Ｈｏｌｉｎ蛋白处于积累阶段，此时细菌浓度缓慢上升，当Ｈｏｌｉｎ蛋白量积累到一定阈值后造成细菌膜结构损伤，此时细菌浓度逐渐下降并维持在较低水平。继续诱导后期至８ｈ，此时Ｈｏｌｉｎ蛋白积累量仍然增加，而细菌浓度也逐步增加，对于这一现象尚需要进一步研究分析。由图５可见，Ｈｏｌｉｎ蛋白在细菌内膜聚集并形成孔道，由于缺少溶菌酶的释放，并不会对胞外结构造成直接破坏，但此时胞内可溶性蛋白、电解质等可通过孔道流失，菌体呈现塌陷、皱缩状态，最终死亡。　　作为噬菌体裂解系统，穿孔素、溶菌酶无论单独使用还是联合使用，均能起到有效抑制细菌增殖的作用［１９］。穿孔素还可以作为转运载体，辅助药物、核酸、蛋白质进入菌体内部，进一步提高抗菌效率［２０－２１］。此外，噬菌体在入侵宿主时需要在菌体表面开孔注入核酸物质，例如Ｔ７噬菌体的ｇｐ１６能够水解细胞壁启动感染，这类蛋白也可以用作抗菌制剂的开发［２２］。本研究对Ｔ７噬菌体的穿孔素进行原核表达，分析该蛋白的结构、评价其抑菌活性，并初步解析其损伤细菌膜结构的机制，这可为进一步研究穿孔素的抑菌机制以及开发利用穿孔素的抗菌活性做出有益的探索。ｐｈａｇｅＴ４［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，２０１０，１９（４）：６３１－６４１．［５］ＪｕｎｎＨＪ，ＹｏｕｎＪ，ＳｕｈＫＨ，ｅｔａｌ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｈａｇｅＫ１１ｌｙｓｏｚｙｍｅｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００５，４２：７８－８４．［６］ＹａｎｇＤ，ＷａｎｇＱ，ＣｈｅｎＬＺ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｐｈａｇｅ－ｔｙｐｅｌｙｓｏｚｙｍｅｆｒｏｍｔｈｅＭａｎｉｌａｃｌａｍ，Ｒｕｄｉｔａｐｅｓｐｈｉｌｉｐｐｉｎａｒｕｍ［Ｊ］．Ｆｉｓｈ＆ＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１７，６５：１７－２４．［７］ＣａｈｉｌｌＪ，ＹｏｕｎｇＲ．Ｐｈａｇｅｌｙｓｉｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｂａｒｒｉｅｒｓ［Ｊ］．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１９，１０３：３３－７０．［８］ＹｏｕｎｇＲ．Ｐｈａｇｅｌｙｓｉｓ：ｔｈｒｅｅｓｔｅｐｓ，ｔｈｒｅｅｃｈｏｉｃｅｓ，ｏｎｅｏｕｔｃｏｍｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，５２（３）：２４３－２５８．［９］ＹｏｕｎｇＲ．Ｐｈａｇｅｌｙｓｉｓ：ｄｏｗｅｈａｖｅｔｈｅｈｏｌｅｓｔｏｒｙｙｅｔ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１６：７９０－７．［１０］Ｍｅｈｎｅｒ－ＢｒｅｉｔｆｅｌｄＤ，ＲａｔｈｍａｎｎＣ，ＲｉｅｄｅｌＴ，ｅｔａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｎａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆａｐｈａｇｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｈｏｌｉｎ／ｅｎｄｏｌｙｓｉｎｓｙｓｔｅｍｔｏｔｏｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓｄｉｆｆｉｃｉｌｅ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔｉｅｒｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，９：２４４６．［１１］ＦｅｒｎａｎｄｅｓＳ，Ｓａｏ－ＪｏｓｅＣ．Ｍｏｒｅｔｈａｎａｈｏｌｅ：ｔｈｅｈｏｌｉｎｌｅｔｈａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｍａｙｂｅｒｅｑｕｉｒｅｄｔｏｆｕｌｌｙｓｅｎｓｉｔｉｚｅｂａｃｔｅｒｉａｔｏｔｈｅｌｙｔｉｃａｃｔｉｏｎｏｆｃａｎｏｎｉｃａｌｅｎｄｏｌｙｓｉｎｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，１０２（１）：９２－１０６．［１２］ＷｈｉｔｅＲ，ＣｈｉｂａＳ，ＰａｎｇＴ，ｅｔａｌ．Ｈｏｌｉｎｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇｉｎｒｅａｌｔｉｍｅ［Ｃ］／／ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１０８，２０１１：７９８－８０３．［１３］Ｐｒｏｅｎ？ａＤ，ＦｅｒｎａｎｄｅｓＳ，ＬｅａｎｄｒｏＣ，ｅｔａｌ．ＰｈａｇｅｅｎｄｏｌｙｓｉｎｓｗｉｔｈｂｒｏａｄａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２０１２，１８（３）：３２２－３３２．［１４］ＭａｔａｍｐＮ，ＢｈａｔＳＧ．Ｐｈａｇｅｅｎｄｏｌｙｓｉｎｓａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓａｇａｉｎｓｔｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓａｎｄｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓｏｆｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓａｈｅａｄ［Ｚ］．２０１９．［１５］ＢｅｒｒｙＪ，ＲａｊａｕｒｅＭ，ＰａｎｇＴ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｓｐａｎｉｎｃｏｍｐｌｅｘｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｌａｍｂｄａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１９４（２０）：５６６７－５６７４．　［１６］ＢｅｒｒｙＪ，ＳａｖｖａＣ，ＨｏｌｚｅｎｂｕｒｇＡ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｌａｍｂｄａｓｐａｎｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓＲｚａｎｄＲｚ１ｕｎｄｅｒｇｏｔｅｒｔｉａｒｙａｎｄｑｕａｔｅｒｎａｒｙｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓｕｐｏｎｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，２０１０，１９（１０）：１９６７－１９７７．［１７］ＹｏｕｎｇＲ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｌｙｓｉｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１９９２，５６（３）：４３０－４８１．

胡珊珊，陈开莉，陈红贤，等．黑水虻抗菌肽的克隆及其生物信息学分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２０，４８（２４）：４９－５２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２０．２４．００９—４９—黑水虻抗菌肽的克隆及其生物信息学分析胡珊珊，陈开莉，陈红贤，邬开鑫，尤忠毓（嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴３１４００１）　　摘要：为了开发新型昆虫抗菌肽资源，以黑水虻幼虫为研究对象，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从黑水虻幼虫总ＲＮＡ中扩增到一个新型抗菌肽基因ＤＬＰ－５，并利用在线生物软件和工具分析了抗菌肽ＤＬＰ－５的生物信息学特征。结果表明，ＤＬＰ－５由４０个氨基酸残基组成，分子量为４２２６．８３ｕ，等电点为７．８７，具有两亲性特征，其中Ｎ端为疏水性，Ｃ端为亲水性，具有３个磷酸化位点，无糖基化位点、信号肽序列和跨膜区。ＤＬＰ－５的三级结构包含１个Ｎ端的ｌｏｏｐ区、１个α螺旋和１对反向平行β折叠，构成了防御素类抗菌肽典型的“环－螺旋－折叠”结构，说明ＤＬＰ－５是一个新型的防御素类抗菌肽，可通过与微生物膜相互作用发挥其抗菌活性。　　关键词：昆虫抗菌肽；黑水虻；基因克隆；生物信息学　　中图分类号：Ｓ１８８　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０２０）２４－００４９－０４　　昆虫抗菌肽是昆虫受到刺激或感染后由体内血淋巴产生的一类小分子碱性多肽，经体内和体外的抗菌活性研究发现，它具有广谱抗菌活性、分子量小、容易合成、不易形成耐药性等特性，可作为传１－２］统抗生素的潜在替代抗菌制剂［。黑水虻究发现，黑水虻抗菌肽具有很好的热稳定性、反复４－５］。Ｐａｒｋ等利用ｃＤＮＡ末端快速扩增技术冻融性［从黑水虻幼虫的ｃＤＮＡ中成功克隆了抗菌肽编码基［６］ＬＰ１－ＤＬＰ４；Ｌｉ等在毕赤酵母中重组表达了因Ｄ黑水虻抗菌肽ＤＬＰ２和ＤＬＰ４，活性研究表明ＤＬＰ２和ＤＬＰ４具有较强的抗菌性能，特别是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有快速的杀灭活性，其最小杀［７］菌浓度（ＭＩＣ）为０．０１μｍｏｌ／Ｌ。Ｅｌｈａｇ等从黑水虻（ＨｅｒｍｉｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓＬ．）是双翅目水虻科扁角水虻属的一种资源昆虫，其幼虫以动物粪便、腐烂的有机物及植物性垃圾为食，在禽畜粪便及餐厨垃圾的无３］害化处理中应用前景广阔［。夏嫱等利用大肠杆幼虫的ｃＤＮＡ中筛选到了７种抗菌肽基因［ｃｅｃｒｏｐｉｎＺ１、ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１、ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ（２ａ）、ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ（２ｂ）、ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ３、ｓｔｏｍｏｘｙｎＺＨ１和ｓｔｏｍｏｘｙｎＺＨ１（ａ）］，并利用大肠杆菌表达系统成功表达了ｓｔｏｍｏｘｙｎＺＨ１，活性研究表明，重组ｓｔｏｍｏｘｙｎＺＨ１对金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、立枯丝核菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）、（核盘菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）均具有较高的抗菌８］活性［。由此可见，黑水虻及其幼虫体内含有丰富菌和金黄色葡萄球菌诱导黑水虻幼虫产生抗菌肽，该抗菌肽可以有效抑制大肠杆菌的生长，稳定性研收稿日期：２０２０－０４－２９基金项目：浙江省嘉兴市科技计划（编号：２０１７ＡＹ３３０８７）；嘉兴学院８５１７１９３１６４）。大学生科研训练计划（编号：作者简介：胡珊珊（１９９９—），女，浙江绍兴人，主要从事天然产物开发研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１４４３７６７１１３＠ｑｑ．ｃｏｍ。通信作者：尤忠毓，博士，副教授，主要从事天然产物开发研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｅｌｍｅｒ０７１８＠１６３．ｃｏｍ。的内源性抗菌肽，本试验旨在克隆新型黑水虻抗菌櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［１８］ＳｕｍｍｅｒＥＪ，ＢｅｒｒｙＪ，ＴｒａｎＴ，ｅｔａｌ．Ｒｚ／Ｒｚ１ｌｙｓｉｓｇｅｎｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｐｈａｇｅｓｏｆＧｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅｈｏｓｔｓ，２００７，３７３（５）：１０９８－１１１２．Ｂｉｏｌｏｇｙ［１９］ＬｕＮ，ＳｕｎＹ，ＷａｎｇＱＱ，ｅｔａｌ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｅｎｄｏｌｙｓｉｎａｎｄｈｏｌｉｎｆｒｏｍＳｐｈｉＳＡＳＤ１ａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｎｏｖｅｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｃａｎｄｉｄａｔｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０２０，１４７：９８０－９８９．［２０］ＳａｉｅｒＭＨＪｒ，ＲｅｄｄｙＢＬ．Ｈｏｌｉｎｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａ，ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，ａｎｄａｒｃｈａｅａ：ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｘｅｎｏｌｏｇｕｅｓｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０１５；１９７：７－１７．［２１］ＰａｒｋＳＹ，ＪｙＬ，ＣｈａｎｇＷＳ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｐｕｒｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｍｉｎｉｃｅｌｌｓｂｙｈｏｌｉｎ／ｌｙｓｉｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ，２０１１，８６（１）：１０８－１１０．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ［２２］ＨｅｉｎｅｍａｎＲＨ，ＭｏｌｉｎｅｕｘＩＪ，ＢｕｌｌＪＪ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓｏｆａｎｏｐｔｉｍａｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ｒｅ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｙｓｉｓｉｎａｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｄｅｌｅｔｅｄ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００５，６１（２）：ｆｏｒｉｔｓｌｙｓｉｎｇｅｎｅ１８１－１９１．