2024年4月11日发(作者：)
药物筛选流程
一、概述
1. 细胞层面的筛选
Cell culture (96-well plate)
Compounds (depend on kinases)+6 repeats
Cell culture
Detecting regents,
Microplate reader (OD)
IC50/EC50 caculation
Two times of repeating assay
2. 酶层面筛选
Kinase Assay
Biotin-Substrate (For example) Cell culture
96-well plate coated with
streptavidin
(For example) Compounds +3 repeats
Compounds (depend on kinases)+ 3 repeats Incubated
Kinase and other regents Protein preparation
Incubated Substrates and detecting regents
Microplate reader (Fluorescence, luminescence, OD,)
IC50/EC50 caculation
Two times of repeating assay
二、
药物筛选流程示例
ELISA检测NRG突变体的活性
目的：
通过检测NRG突变体刺激ErbB2/ErbB3 及ErbB2/ErbB4表达细胞的酪氨酸磷酸
化，评价其生物活性。
原理：
KIRA(kinase receptor activation)是一种新型的生物测定方法，它通过测定配
基诱导的受体酪氨酸激酶磷酸化形式的活化，能够快速、准确、灵敏地定量测定
配基的生物活性。
HER2/neu基因编码具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白p185，常与ErbB3
或ErbB4形成异源二聚体，通过ErbB3或ErbB4与相应配体Neuregulin-1的结
合，激活HER2编码的酪氨酸蛋白激酶，使其相应位点磷酸化。利用NRG-1能
与细胞表面ErbB3/ErbB4分子结合、介导ErbB2蛋白磷酸化的这一特性，可用
KIRA-ELISA法测定rhNRG-1及其突变体蛋白的体外生物学活性。
材料：
1、96孔细胞培养板（BD FALCON
®
）；Nunc MaxiSorp 酶标检测板。
2、IMDM培养基，透析胎牛血清（PAA），G418，MTX，胰酶，PBS等。
3、鼠抗人ErbB2单克隆抗体H4，公司自制。
4、辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠抗人磷酸化酪氨酸蛋白单抗
p-Tyr(PY99):Sc-7020 HRP(Santa Cruz Biotechnology)。
5、细胞裂解液：150mM NaCl+50mM Hepes+1%Triton-X 100+2 mM钒酸钠
（sodium orthovanadate）+0.01%硫柳汞（thimerosol）。临用前每25ml加入一片
混合蛋白酶抑制剂（Protease-inhibitor-cocktail Tablet，Roche）。
6、TMB显色系统（TMB、底物缓冲液、终止液2N H
2
SO
4
）。
7、稳定转染2, 4-CHO细胞；瞬时转染2,3-COS-7细胞。
技术路线：
细胞培养→NRG刺激→细胞裂解→裂解液中p-Tyr ELISA检测
方法：
一、标准程序：
1、接种细胞。96孔细胞培养板，2,4-CHO细胞每孔接种5~6×10
4
个细胞，37℃，
5% CO
2
培养箱培养24hr。
COS-7每孔接种3×10
4
个细胞，次日做瞬时转染，作为2,3-COS-7细胞，转
染24h后饥饿。
2、细胞饥饿。吸净96孔板中的培养基，用37℃温育后的PBS清洗细胞，然后
加入100 μl IMDM基础培养基（不含附加成分），置37℃，5%CO
2
培养箱培养
24hr以上。
对COS-7细胞，则先对细胞进行ErbB2/ErbB3质粒共转染。24h后再进行细
胞饥饿操作。
3、包被酶标板。用包被缓冲液稀释抗ErbB2抗体至8 μg/ml，以70 μl /孔加至96
孔酶标板内，置4℃过夜（16～18hr）。
4、封闭酶标板。洗板5次。用洗涤液配5%脱脂奶粉，以200 μl/孔加至板内，
置37℃ 2hr。洗板5次，待用。
5、配制标准品和样品溶液。在一块96孔微孔板中，将标准品及待测样品用
IMDM基础培养基稀释至2 μg/ml，再依次作3倍梯度稀释，共做7个稀释度。
每个稀释度做4个复孔。
6、刺激细胞磷酸化。将饥饿后的96孔细胞培养板中培养基吸净，与96孔微孔
板相对应，分别加入标准品和测试样品溶液，100μl /孔，同时设置阴性对照（即
IMDM培养基空白对照）。37℃，5%CO
2
培养箱作用20min。
7、细胞裂解。迅速吸去刺激溶液并用PBS洗涤一遍，然后加入100 μl细胞裂解
液，置4℃冰箱，微量振荡器上振荡裂解30min使细胞完全脱落。4℃，3000rpm
离心15min。
8、加样。将标准和待检样品对应的细胞裂解液均以90 μl/孔加至封闭好的酶标板
内，置37℃1hr。
9、加酶标抗体。洗板5次。用洗液1：600稀释p-Tyr-HRP抗体，以100 μl/孔加
至酶标板内，37℃ 孵育1hr。
10、底物显色。洗板5次。以100 μl/孔加入新鲜配制的底物工作液，37℃显色
10min左右（需根据颜色深浅适当调整）。
11、终止。以50 μl/孔加入2N H
2
SO
4
，终止显色。
12、测定O.D.450。将板放入酶标仪中，选择测定波长450nm，参比波长655nm
测O.D.值，记录测定结果。
样品制备及步骤：
（1） 标定NRG对照、突变体蛋白47R与47K的蛋白浓度；
（2） 按所标定的浓度验证47R与47K的生物活性：
a. 用2, 4-CHO细胞验证47R与47K的活性，同时用瞬时转染的方法获得
2, 4-COS7细胞，测定47R与47K对2, 4-COS7细胞的生物活性，比较这
两种细胞体系测定结果是否一致；
b. 验证47R与47K 对2, 3-COS7细胞的活性。
Ⅱ 细胞接种：
（1） COS-7细胞接种：消化一瓶COS-7细胞，计数后按3×10
4
/孔接种于96孔
板，共接种4块培养板，其中2块用于转染ErbB2/ErbB3，另2块用于转
染ErbB2/ErbB4。剩余细胞继续培养保种。
（2） 2, 4-CHO细胞接种：消化2瓶2, 4-CHO细胞，计数为1.65×10
7
个，调整
密度按5×10
4
/孔接种于96孔板，共接种2块培养板，分别用于测定47R
与47K的生物活性。剩余细胞继续培养。
Ⅲ BCA测定结果：
标准曲线：
BSA标准曲线（08-3-10）
2.500
2.000
y = 0.0009x + 0.166
R
2
= 0.999
O
.
D
.
5
6
2
1.500
1.000
0.500
0.000
BSA浓度（μg/ml）
20002500
080311：
Ⅰ 2, 4-CHO细胞饥饿；
Ⅱ COS-7细胞转染：
（1） ErbB2/ErbB3共转染：ErbB2质粒浓度549 μg/ml,ErbB3质粒浓度450
μg/ml。转染体系为：每块板50 μlT-gene转染试剂+1 mlDMEM+DNA各
20 μg。转染过程为：
a) 将转染试剂T-gene加入无血清DMEM培养基，混匀后放置2-3min；
b) 将质粒DNA缓缓加入T-gene/DMEM复合物，混匀室温放置30min；
c) 将以上混合物平均分配到细胞培养孔，轻摇混匀，细胞放入培养箱继续培
养。
（2） ErbB2/ErbB4共转染：ErbB2质粒浓度549 μg/ml,ErbB4质粒浓度285
μg/ml。按1：1比例共转染。转染过程与ErbB2/ErbB3相同。
Ⅲ 实验孔设计
2,4-CHO细胞，2,3-COS-7及2,4-COS-7均按下表安排进行实验，其中，2,4-CHO
细胞于12日进行刺激，瞬转细胞于13日进行刺激：
080312：
Ⅰ 2,3-COS-7及2,4-COS-7细胞饥饿。
由于细胞密度高，在加入PBS洗细胞后有较多细胞脱落，有的孔细胞脱落比较
严重，可能会影响实验结果。
Ⅱ KIRA-ELISA测定NRG、47R及47K对 2,4-CHO细胞的生物活性。
a． 蛋白溶液配制。
1）先按工作液配制表将蛋白统一配制为浓度250μg/ml的工作液；
2）如表2所示方法稀释蛋白。取两块国产酶标板，用排枪按列分别加入相应体
积的IMDM基础培养基，然后向第1列加入50μl的工作液，则第1列即得
到5倍稀释，浓度为50μg/ml。吹打均匀后，自第1列取出50μl液体加到第
2列，换枪头，将第2列吹打均匀，取出50μl加到第3列。如此依次稀释，
即可将蛋白稀释到表2最后一行所示的终浓度。
表1：工作液配制表
工作液浓度
蛋白名称
原液浓度（μg/ml）
1ml工作液所需原液
（μl）
补加IMDM（μl）
0.5ml工作液所需原液
（μl）
补加IMDM（μl）
表2：蛋白稀释方法
A
B 200μl
1 2
20
0
20
0
20
0
20
0
20
3
20
0
20
0
20
0
20
0
20
140
4
140
5
140
6
140
7
140
8
140
9 10
140
11
14
0
14
0
14
0
14
0
14
250μg/m
l
NRG
1578.89
158.3
841.7
79.2
420.8
47R
1854.44
134.8
865.2
67.4
432.6
47K
3374.44
74.1
925.9
37.0
463.0
C 200μl 140 140 140 140 140 140 140
D 200μl 140 140 140 140 140 140 140
E
F
200μl
200μl
140
140
140
140
140
140
140
140
140
140
140
140
140
140
0
G 200μl
20
0
+5
0
10
0
20
0
+5
0
2
140
+70
0.6666
7
140
+70
0.2222
2
140
+70
0.0740
7
140
+70
0.0246
9
140
+70
0.0082
3
140
+70
0.0027
4
140
+70
0.0009
1
0
14
0
0
H
+50μl
终浓
50μg/m
度
l
0
b．刺激细胞磷酸化。
去掉培养孔中的培养液，将配制好的蛋白溶液按列对应加到细胞培养板中。37℃
作用20min。
c． 细胞裂解。
弃去蛋白溶液，每孔加入100μl冷的PBS洗细胞一次。然后加入100μl细胞裂解
液，4℃振荡裂解30min。然后4℃，3000rpm离心15min。
d．ELISA测定。
用排枪自每孔取出90μl细胞裂解液，对应加到酶标板中，37℃孵育1h。洗板后
加p-Tyr-HRP抗体，37℃孵育1h。洗板，TMB显色，2N H
2
SO
4
终止后测定450nm
处的吸光值。
测定结果分析：
略
S型剂量效应曲线：
略
结果分析：
此次测定整体吸光值偏小，最高只有0.3左右，因此很不理想。以往同等条件下
最高吸光值一般在0.8左右。可能的原因有：（1）细胞。重新复苏的细胞受体表
达水平可能有变化，如果受体较少则磷酸化信号不强；（2）ELISA过程中的因素，
尤其是显色系统。这其中牵涉到因素较多，但可以通过设立阳性对照来鉴别。由
于MCF-7细胞的磷酸化反应是相对稳定的，可以接入一列MCF-7细胞来作为整
个过程的阳性对照。
从结果来看，47R及47K的效价相对NRG有所提高。
Ⅰ KIRA-ELISA测定NRG、47R及47K对 2,4-COS-7及2,3-COS-7细胞的生物
活性。
a． 蛋白溶液配制。
1）配制浓度为250μg/ml的工作液；
2）将工作液梯度稀释到所需的各个浓度。
b．刺激细胞磷酸化。
去掉培养孔中的培养液，将配制好的蛋白溶液对应加到细胞培养板中。37℃作用
20min。2,4-COS-7细胞与2,3-COS-7细胞间隔30min以上进行，错开操作以充分
利用时间并避免冲突。
c． 细胞裂解。
弃去蛋白溶液，每孔加入100μl冷的PBS洗细胞一次。然后加入100μl细胞裂解
液，4℃振荡裂解30min。然后4℃，3000rpm离心15min。
d．ELISA测定。
用排枪自每孔取出90μl细胞裂解液，对应加到酶标板中，37℃孵育1h。洗板后
加p-Tyr-HRP抗体，37℃孵育1h。洗板，TMB显色，2N H
2
SO
4
终止后测定450nm
处的吸光值。
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