2024年5月3日发(作者：无水印音乐mv视频素材)

标准全胚胎原位杂交方法

Standard Whole-Mount in Situ Hybridization

试剂配制

10×PBS(1L pH 7.4)用MilliQ水稀释10倍后，高压灭菌使用

0.2M NaH

2

PO

4

113mL

0.2M Na

2

HPO

4

387mL

5M NaCl 200 mL

用MilliQ水定容至1000 mL

PBT：0.1% Tween-20/PBS （室温保存）配制后，不可高压

固定液：4%多聚甲醛（PFA）/PBS （使用时配制）

使用前，用PBS稀释20%的多聚甲醛（4℃保存）至4%，一周内使用

100%乙醇，室温保存

20μg/mL Proteinase K/PBT，使用时配制

Proteinase K分装-20℃冷冻保存，使用前，用PBT稀释，解冻后马上使用，冰箱中有

1000*的稀释液。

甘氨酸有10*，现用现配。

预杂交液（50mL）

50%甲酰胺

5× SSC(pH7.0)

2%封闭剂

0.1% Tween20

0.1% CHAPS

1μg/mL酵母tRNA

5mM EDTA

50μg/mL肝素

DIG标记

50%甲酰胺

5× SSC(pH4.5)

1%SDS

25%，50%，75%乙醇/PBT，室温保存

配制后室温放置一段时间，因该试剂可能有小气泡，最好不要马上使用

RNA探针

SSCFS(Solution 1) 因室温下会产生白色沉淀，须分装保温

如配制10ml： 5ml甲酰胺，2.5ml 20*sscPH4.5, 1ml 10%SDS, dd水补足。

Solution 2 5×SSC(pH7.0)/1% tween20

如40ml：10ml 20*SSC, 400ul 10%tween20, dd水补足。

Solution 3 2×SSC (pH7.0)/50% 甲酰胺

如10ml: 1ml 10%SDS, 1ml 20*SSC, 5ml 甲酰胺，dd水补足。

KTBT 40ml

50mM Tris-HCl (pH7.5) 2ml

150mM NaCl 1.2ml 5M NaCl

10mM KCl 400ul 1M KCl

0.1% Tween20 40ul dd

封闭剂

用KTBT溶解1.5% Blocking Reagent

如1ml: KTBT 900ul, 100ul封闭剂。

Anti-DIG

原液用solution和NT buffer稀释5000倍.

NTMT 用时配制 50ml

0.1M NaCl 1ml 5M NaCl

0.1M Tris-HCl (pH9.5) 5ml 1M Tris7.5

50mM MgCl

2

0.1%Tween20 500ul

dd水补足

NTMT-PA(AP Buffer) 用时配制 此步可省略

0.1M NaCl

0.1M Tris-HCl (pH9.5)

50mM MgCl

2

0.1%TritonX-100

5% PVA(70～100kD)

下述溶液用时配制，室温保存

5M NaCl

1M Tris-HCl (pH9.5)

1M MgCl

2

10%TritonX-100

AP Buffer配制方法

PVA 2.5g

5M NaCl 1.0mL

1M Tris-HCl (pH9.5) 5.0mL

MilliQ水 45 mL

90℃加热溶解PVA，室温下冷却

10% TritonX-100 0.5 mL

1M MgCl

2

2.5 mL

水补足

冰箱中有直接使用的。

2.5ml 1M MgCl

缓慢搅拌，MilliQ水定容

染色液（NBT/BCIP） 每1 mL AP Buffer中加入8 L NBT/BCIP 可用NTMT配

NBT/BCIP溶液（-20℃保存）：NBT 75mg/70% Dimethyl formamide 1 mL

BCIP溶液（-20℃保存）：BCIP 50mg/70% Dimethyl formamide 1 mL

NBT

氯化硝基四氮唑蓝,硝基蓝四氮唑或硝基氯化四氮唑蓝,分子式C40H30Cl2N10O6,分子量

817,65 g/mol, BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会

被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的

NBT-formazan。也是一种很好的脂蛋白染色剂

过程

尽量都采用慢摇，小心不要剧烈！适当翻动小胚胎，防止小网印下痕迹，

防止网上的脏东西粘在上面。

1、胚胎固定与脱水

a) 将取出的小鼠胚胎放入固定液中，4℃，2小时至一夜固定

b) 弃液体，加入PBT，4℃，漂洗5分钟，重复两次

c) 按以下步骤脱水，更换液体，4℃，

25%乙醇/PBT 5分钟

50%乙醇/PBT 5分钟

75%乙醇/PBT 5分钟

100%乙醇/PBT 5分钟（×2）

然后可以-20℃保存

2、水饱和·蛋白酶K处理

a) 按以下步骤进行水饱和 等小胚胎沉到下面开始计时

75%乙醇/PBT 5分钟

50%乙醇/PBT 5分钟

25%乙醇/PBT 5分钟

b) 加入2~20μg/mL 蛋白酶K/PBT，室温5~20分钟处理 一般5min

大胚胎，12.5天以上的7min左右 小孔中操作 没过小胚胎即可 作用时间可以镜检

看外面的膜有毛刺或小气泡必须停止 严格计时

PBT 5分钟

PBT 5分钟

c) 立即放入2mg/mL甘氨酸/PBT溶液，5分钟，停止蛋白酶K反应，没过胚胎；

d) PBT洗净（×3次）

此时镜检一下，看看有无脏东西，气泡。尽量除去，不要损害胚胎，但外层膜可以撕

去。

3、杂交

捞出小胚胎，加入0.2mL预杂交液（用量根据胚胎大小而定），用2.0的EP管， 68

度 1h 预杂交。

加入含有一定量的探针的杂交液，探针终浓度为500 ng/mL65~70℃过夜

4、清洗·抗体反应·染色 5ml平皿操作。

a) 回收杂交液（-20℃保存，可再使用）

b) 吸出液体，加入保温的Solution 1，70℃，20分钟

c) 吸出液体，加入保温的Solution 2，70℃，20-30分钟

d) 吸出液体，加入保温的Solution 3, 70℃，20-30分钟

e) 吸出液体，室温下用KTBT漂洗10分钟

f) 吸出液体，加入封闭剂，1小时 小孔操作

g) 吸出液体，加入抗-DIG抗体溶液，37度，1小时 小孔操作

h) 吸出液体，室温下用KTBT漂洗0.5小时（×2次）

i) 吸出液体，用NTMT室温下，漂洗15分钟 2次

j) 吸出液体，加入NTMT稀释的8ul/ml染色液，室温，遮光

5、停止染色·脱色·透明化

a) 染色开始30分钟后，在显微镜下观察染色程度（每10分钟一次，1小时~4小时左

右）看到有的部位颜色特异性变得很深即可。适当翻动胚胎，防止网格印上痕迹染

色不均匀。

b) 在染色最合适的时候，加入PBT，停止染色

c) 吸出液体，加入PBT，室温漂洗5分钟（×3次）

d) 按以下顺序脱色

50%乙醇/PBT 5分钟

100%乙醇 5~10分钟（镜下观察脱色情况）

50%乙醇/PBT 5分钟

PBT

e) 按以下顺序透明化

25%甘油/PBT 5分钟

50%甘油/PBT 5分钟

(f)4℃保存