2024年4月11日发(作者：)

※加工工艺

Journal of Dairy Science and Technology

2017, Vol.40 No.5 8

复合酶水解乳清蛋白制备抗氧化肽的工艺优化

张

萍

1,2

，陈

合

1,

*

，廖

娜

1

（1.陕西科技大学职业教育师范学院，陕西 西安 710021；2.咸阳职业技术学院仪祉农林学院，陕西 咸阳 712000）

摘 要：

以乳清蛋白为原料，采用酶法水解，分析酶解温度、

pH

值、底物浓度和酶底比对复合酶水解乳清蛋

白的影响，通过单因素试验确定各因素的最适工艺参数，再通过正交试验及验证实验进一步确定乳清蛋白的最

佳酶解条件。结果表明：根据单因素试验结果，并综合考虑水解度、

1,1-

二苯基

-2-

三硝基苯肼（

1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl

，

DPPH

）自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和铁离子螯合能力

4

项指标的正交试验结果，最

终确定乳清蛋白的最佳酶解条件为酶解温度

60

℃、

pH 8.5

、底物质量浓度

2.5 g

/

100 mL

、酶底比

3.5

%

。以上述最佳

参数为酶解条件进行验证实验的结果表明，验证实验结果与正交试验结果相符，进一步验证了本研究确定的酶解条

件为最佳条件。

关键词：乳清蛋白；抗氧化肽；酶解；工艺优化

Process Optimization for Preparation of Antioxidant Peptides by Enzymatic Hydrolysis of Whey Protein

Concentration with Protamex

ZHANG Ping

1,2

, CHEN He

1,

*

, LIAO Na

1

(onal Education and Normal College, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an

Agriculture and Forestry Department, Xianyang Vocational and Technical College, Xianyang

710021, China;

712000, China)

Abstract: The enzymatic hydrolysis of whey protein concentration for preparing antioxidant peptides was optimized using

one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The independent variables selected were temperature, pH, substrate

concentration, and enzyme-to-substrate ratio. The responses were degree of hydrolysis, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

(DPPH) and superoxide anion radical scavenging capacity, and ion chelating capacity. The optimal hydrolysis conditions

were found to be hydrolysis at 60

℃

and pH 8.5 at a substrate concentration of 2.5 g

/

100 mL with an enzyme-to-substrate

ratio of 3.5

%

. Furthermore, the optimized values of process parameter were experimentally validated.

Key words: whey protein; antioxidant peptide; enzymatic hydrolysis; process optimization

DOI:10.15922

/

.2017.05.002

中图分类号：

TS252.4

文献标志码：

A

引文格式：

张萍

,

陈合

,

廖娜

.

复合酶水解乳清蛋白制备抗氧化肽的工艺优化

[J].

乳业科学与技术

, 2017, 40(5): 8-11.

DOI:10.15922

/

.2017.05.002

. http:

//

ZHANG Ping, CHEN He, LIAO Na. The process optimization of preparing oxidation of titanium with compound

enzyme hydrolysis whey protein[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2017, 40(5): 8-11.

DOI:10.15922

/

.

jdst.2017.05.002

. http:

//

文章编号：1671-5187（2017）05-0008-04

乳清蛋白是公认的优质蛋白质之一，具有高生物

价、高蛋白质功效、高利用率等特点

[1]

，营养价值极高，

富含多种人体必需氨基酸

[2]

，且乳清蛋白中酪氨酸、亮氨

酸、异亮氨酸、苏氨酸和赖氨酸的含量比酪蛋白中高

[3]

。

乳清蛋白的抗氧化性集中体现在一级结构的低分子

质量短肽中，采用特定方法处理乳清蛋白就可以将其功

能性肽释放出来

[4]

。沈浥

[5]

用胰蛋白酶水解乳清蛋白，发

现当乳清蛋白质量浓度为

30 mg

/

mL

、温度为

50

℃、酶

底比为

2

%

、

pH 7.6

时，酶解

90 min

的水解度可达

19

%

，

1,1-

二苯基

-2-

三硝基苯肼（

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

，

DPPH

）自由基清除率为

78.78

%

。王雪等

[6]

优化了酶法制

备乳清抗氧化肽的工艺，发现当水解度达

32.28

%

时，水

收稿日期：2017-08-28

基金项目：陕西省农业厅重大科技创新计划项目（NYKJ2015-004）

作者简介：张萍（1983—），女，讲师，硕士研究生，研究方向为生物技术及应用。E-mail：46231805@

*通信作者：陈合（1956—），男，教授，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：chenhe@

9 2017, Vol.40 No.5

乳业科学与技术

※加工工艺

解物的抗氧化能力最强。包毅宁

[7]

用碱性蛋白酶水解和瑞

士乳杆菌发酵

2

种方法制备乳清多肽，探究其抗氧化活

性，并用动物实验进行抗氧化活性验证。彭新颜等

[8]

研究

乳清蛋白的碱性蛋白酶水解产物在不同体系中的抗氧化

活性，结果表明，当底物浓度为

5%

、加酶量为

2%

时，

酶解

5 h

后产物的抗氧化活性最高，且其抗氧化活性与

底物浓度、酶解时间和溶解度有关。本研究以酶解乳清

蛋白时的酶解温度、

pH

值、底物浓度和酶底比为影响因

素，通过单因素试验和正交试验确定乳清蛋白的最佳酶

解条件。

1 材料与方法

1.1

 材料与试剂

碱性蛋白酶、中性蛋白酶（均为分析纯） 江苏

锐阳生物科技有限公司；胰蛋白酶、复合蛋白酶、蛋白

酶

K

、

Alcalase

、

Tris-HCl

缓冲液（均为分析纯）、牛血清

白蛋白（生化试剂） 西安罗森博生物科技有限责任

公司；浓缩乳清蛋白（食品级） 美国

Hilmar

公司；氢

氧化钠（食品级） 郑州晟鑫生物科技有限公司；氢

氧化钠（分析纯） 郑州派尼化学试剂厂；

95

%

乙醇

（分析纯）、磷酸（生化试剂） 天津市红岩试剂厂；

焦性没食子酸、氯化亚铁（均为分析纯） 天津市福

晨化学试剂厂；

DPPH

（分析纯）、啡洛嗪（生化试剂） 

美国

Sigma

公司；乙二胺四乙酸钠（分析纯） 天津市

天力化学试剂有限公司。

1.2

 仪器与设备

pH S-3C

酸度计、

FA2104S

电子天平 上海精密科

学仪器有限公司；

DK-98-1

电热恒温水浴锅 天津市泰

斯特仪器有限公司；

UV-5300PC

紫外分光光度计 上海

元析仪器有限公司；

GT-10

离心机 北京时代比利离心

机有限公司。

1.3

 方法

1.3.1

 单因素试验设计

以乳清蛋白水解度、

DPPH

自由基清除率、超氧阴离

子自由基清除率和铁离子螯合能力为指标，计算方法参考

Sun Ting

等

[9]

的方法，利用单因素试验考察酶解温度、

pH

值、底物浓度和酶底比对酶解液抗氧化活性的影响

[10]

。

分别在

55

、

60

、

65

、

70

、

75

℃条件下水解

90 min

[11]

，乳清蛋白溶液质量浓度

2 g

/

100 mL

、酶底比

3

%

（质量分数，下同）、

pH 8.0

。水解过程中滴加

0.1 mol

/

L

氢氧化钠溶液，调节

pH

值至

8.0

，记录氢氧化钠溶液的消

耗量，计算水解度；酶解结束后立即取样，测定其抗氧

化活性指标，考察酶解温度对复合酶水解乳清蛋白的影

响，确定最适酶解温度。

分别在

pH

值为

7.0

、

7.5

、

8.0

、

8.5

、

9.0

条件下水解

90 min

[12]

，乳清蛋白溶液质量浓度

2 g/

100 mL

、酶底比

3%

、酶解温度

65

℃，测定样品水解度及抗氧化活性指

标，考察

pH

值对复合酶水解乳清蛋白的影响，确定酶解

反应最适

pH

值。

分别在乳清蛋白溶液底物质量浓度为

1.0

、

1.5

、

2.0

、

2.5

、

3.0 g

/

100 mL

条件下水解

90 min

[13]

，酶解温度

65

℃、

pH 8.0

、酶底比

3

%

，测定样品水解度及抗氧化活

性指标，考察底物浓度对复合酶水解乳清蛋白的影响，

确定酶解反应最适底物浓度。

分别在酶底比

2.0

%

、

2.5

%

、

3.0

%

、

3.5

%

、

4.0

%

条件

下水解

90 min

[14]

，酶解温度

65

℃、

pH 8.0

、底物质量浓度

2 g

/

100 mL

，测定样品水解度及抗氧化活性指标，考察酶

底比对复合酶水解乳清蛋白的影响，确定酶解反应最适

酶底比。

1.3.2

 正交试验设计

根据单因素试验结果，以乳清蛋白水解度、

DPPH

自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和铁离子螯合

能力为指标，设计

L

9

（

4

3

）正交试验，对酶解温度、

pH

值、底物质量浓度和酶底比进行四因素三水平正交试验

设计，确定乳清蛋白的最佳酶解条件

[15]

。

1.4

 数据处理

采用正交设计助手

V 3.1

专业版软件进行正交试验设

计和结果分析，采用

Origin 8.0

软件绘图。

2 结果与分析

2.1

 单因素试验结果

以乳清蛋白水解度、

DPPH

自由基清除率、超氧阴

离子自由基清除率和铁离子螯合能力为指标，利用单因

素试验考察酶解温度、

pH

值、底物质量浓度和酶底比对

酶解液抗氧化活性的影响。结果表明：酶解反应最适酶

解温度为

65

℃、最适

pH

值为

8.5

、最适底物质量浓度为

2.5 g

/

100 mL

、最适酶底比为

3.5

%

。

2.2

 正交试验结果

2.2.1

 正交试验结果及方差分析

表 1 正交试验因素水平表

Table 1 Level and code of independent variables used for orthogonal

array design

因素水平

A

B pH

值

C

温度

酶解

/

℃（

底物质量浓度

g

/

100 mL

/

）

D

酶底比

/%

1608.02.0

3.0

2658.52.53.5

3709.03.04.0

※加工工艺

Journal of Dairy Science and Technology

2017, Vol.40 No.5 10

表 2 正交试验结果

Table 2 Orthogonal array design in terms of coded levels with

experimental values of response variables

序号

AC

水解

温度

酶解

/

℃

B pH

值

（

底物质量浓度

g

/

100 mL

/

D

）底比

酶

/%

度

/%

DPPH

自由基

超氧阴离子铁离子

清除率

/%

自由基清除率

/%

螯合能力

/%

1111137.5067.8127.2748.42

2122242.6270.0529.5549.62

3133339.1762.4322.7342.02

4212334.4060.2422.7346.44

5223130.8759.1918.1838.94

6231230.7558.5719.1035.11

7313230.6255.0521.3636.23

8321337.9159.6223.6439.15

9332131.8556.3821.3636.50

以水解度为指标

k

1

39.76334.17335.38733.407

k

2

32.00737.13336.29034.663

k

3

33.46033.92333.55337.160

R

7.7563.2102.7373.753

以

DPPH

自由基清除率为指标

k

1

66.76361.03362.00061.127

k

2

59.33362.95362.22361.223

k

3

57.01759.12758.89060.763

R

9.7463.8263.3330.460

以超氧阴离子自由基清除率为指标

k

1

26.51724.54724.09723.030

k

2

20.00323.03023.78722.577

k

3

22.12021.06320.75723.033

R

6.5143.4843.3400.456

以铁离子螯合能力为指标

k

1

46.68743.69740.89341.287

k

2

40.16342.57044.18740.320

k

3

37.29337.87739.06342.537

R

9.3975.8175.1202.220

表 3 正交试验结果的方差分析

Table 3 Analysis of variance of the results of orthogonal array design

方差

F

比

显著性

来源

水解度

DPPH

自由

超氧阴离子 铁离子水解

螯合能力度

DPPH

基清除率

自由

超氧阴离子铁离子

基清除率自由基清除率自由基清除率螯合能力

A

酶解温度

8.744440.705159.98618.716

－

***

B pH

值

1.64062.22444.2087.681

－

**

－

C

底物质量浓度

1.00059.01749.3555.434

－

**

－

D

酶底比

1.8781.0001.0001.000

－－－－

注：

*

.差异显著（

P

＜0.05）；－.差异不显著。

由表

1

～

3

可知，影响乳清蛋白酶解的各因素之间的

主次关系为：

1

）以水解度为指标时，酶解温度＞酶底

比＞

pH

值＞底物质量浓度；

2

）以

DPPH

自由基清除率

为指标时，酶解温度＞

pH

值＞底物质量浓度＞酶底比；

3

）以超氧阴离子自由基清除率为指标时，酶解温度＞

pH

值＞底物质量浓度＞酶底比；

4

）以铁离子螯合能力为

指标时，酶解温度＞

pH

值＞底物质量浓度＞酶底比。

2.2.2

最佳酶解条件的确定

由表

3

可知，酶解温度、

pH

值、底物质量浓度和酶

底比对水解度的影响均不显著。由图

1

可知，根据以水

解度为指标的极差变化趋势得到的最佳工艺参数组合为

A

1

B

2

C

2

D

3

，即酶解温度

60

℃、

pH

值

8.5

、底物质量浓度

2.5 g/100 mL

、酶底比

4.0%

。

40

%

38

/