2024年4月20日发(作者：ie修复windows7)

天津医药2021年8月第49卷第8期

829

实验研究

小肠结肠炎综合征小鼠肠黏膜中NLRP3表达与炎症分子

关系的研究

李娟

1

，袁向飞

2

，赵煜

1△

摘要：目的探讨食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征（FPIES）小鼠肠黏膜细胞中炎症小体NOD样受体热蛋白结

利用卵清蛋白灌胃建构域相关蛋白3（NLRP3）表达水平，明确NLRP3异常与炎症分子及细胞焦亡的关联性。方法

立食物蛋白诱导FPIES小鼠模型；实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和Westernblot方法检测肠黏膜细胞NLRP3、

炎症分子及细胞焦亡通路分子的表达水平；采用药物干预黏膜细胞，分别抑制和激活NLRP3，Westernblot方法检测

肠黏膜细胞炎症分子及细胞焦亡通路分子表达的改变情况。结果FPIES小鼠肠黏膜细胞中NLRP3、炎症分子及细

胞焦亡通路分子表达水平显著上调（P＜0.05）；激活NLRP3表达，可以诱导炎症分子及细胞焦亡通路分子表达显著

上调，抑制NLRP3表达，可以显著上调炎症分子转化生长因子（TGF）-β和肿瘤坏死因子（TNF）-α表达（P＜0.05）。结论

FPIES小鼠肠黏膜细胞NLRP3表达与炎症反应及细胞焦亡密切相关，是调控FPIES肠道病理表型的上游靶标分子。

关键词：小肠结肠炎；Nod信号接头蛋白质类；细胞焦亡；小鼠，近交BALBC；肠黏膜细胞

中图分类号：R725.7文献标志码：ADOI：10.11958/20211089

RelationshipbetweenNLRP3andinflammatorymoleculesexpressioninintestinalmucosa

cellsofmicewithFPIES

1DepartmentofGastroenterology,TianjinChildren'sHospital,Tianjin300134,China;2TianjinKeyLaboratoryof

AcuteAbdomenDiseaseAssociatedOrganInjuryandITCWMRepair,IntegratedChineseandWesternMedicineHospital,

TianjinUniversity

∆

LIJuan

1

,YUANXiang-fei

2

,ZHAOYu

1△

CorrespondingAuthorE-mail:zhaoyu1617@

foodprotein-inducedenterocolitissyndrome(FPIES),andtoclarifytherelationshipbetweeninflammatorymoleculesand

s

scentquantitativePCRandWesternblotmethodswereusedtodetectthe

theexpressionlevelsofinflammatorymoleculesandpyrolyticpathwaymoleculesinintestinalmucosalcellsafteractivating

s

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelofNLRP3inintestinalmucosalcellsofmousemodelwith

TheFPIESmousemodelwasestablishedby

expressionlevelsofNLRP3,nblotassaywasusedtodetect

intestinalmucosalcellsweresignificantlyup-regulatedinFPIESmodelmice(P＜0.05).TheactivationofNLRP3

expressioncouldsignificantlyup-regulatetheexpressionofinflammatorymoleculesandpyrolyticpathwaymolecules,and

Conclusion

pyroptosisinFPIESmodelmice,whichistheupstreamtargetmoleculetoregulateFPIESintestinalpathologicalphenotypes.

Keywords:enterocolitis;Nodsignalingadaptorproteins;pyroptosis;mice,inbredBALBC;intestinalmucosacell

TheexpressionofNLRP3inintestinalmucosalcellsiscloselyrelatedtotheinflammatoryresponseandcell

theinhibitionofNLRP3expressioncouldsignificantlyup-regulatetheexpressionofTGF-βandTNF-α(P＜0.05).

TheexpressionlevelsofNLRP3,inflammatorymoleculesandpyrolyticpathwaymoleculesin

食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征（food

protein-inducedenterocolitissyndrome，FPIES）是一

种非免疫球蛋白E（IgE）介导的胃肠道过敏性疾病，

通常表现为摄入特定食物后的延迟性胃肠道症

状

［1］

。该病主要患病群体为婴幼儿，多由牛奶或大

豆蛋白引起，其他食物也可触发。FPIES临床分为

急性和慢性。急性FPIES患儿在4h内反复呕吐，同

时伴有水样腹泻；而慢性FPIES患儿通常发生在4月

作者单位：1天津市儿童医院消化科（邮编300134）；2天津大学中西医结合医院，天津市急腹症器官损伤与中西医修复重点实验室

作者简介：李娟（1978），女，硕士，副主任医师，主要从事儿童消化道疾病的临床与基础研究。E-mail：@

△

通信作者E-mail：zhaoyu1617@

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830

龄以下的婴儿，出现间歇性呕吐、慢性水样腹泻和一

定时间内的发育不全等症状。该病病情严重时可导

致患儿出现脱水、低血容量性休克及体质量增加缓

慢等临床症状。慢性FPIES在亚洲国家更为常

见

［2］

。目前对于FPIES发病机制存在较多争议，仍

缺乏有效的特异性诊断方法。该病易被误诊为急性

病毒性肠炎、坏死性小肠结肠炎或脓毒症等，常在发

病数月后才被最终确诊为FPIES。因此，早期诊断

和及时有效的治疗成为临床医生关注的热点。炎症

小体作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应和疾

病发生过程中具有重要作用。炎症小体能够识别病

原相关分子，招募和激活促炎症蛋白酶含半胱氨酸

的天冬氨酸蛋白水解酶（CASP）-1，切割白细胞介素

（IL）-1β和IL-18前体分子，产生相应的抗炎细胞因

［3-4］

子，参与针对多种病原体的宿主防御反应。本研

究通过FPIES的小鼠模型，探讨炎症小体NOD样受

体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）在肠黏膜中的

表达水平，明确其与肿瘤坏死因子（TNF）-α、转化生

长因子（TGF）-β和IL-1β等炎症因子表达的相关性，

阐述NLRP3作用下肠黏膜细胞焦亡的发生情况，为

探索FPIES早期诊断及新的治疗方法提供理论支持。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器6周龄雄性清洁级BALB/c小鼠20

只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级环境饲

养。胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、DMEM培养

基、CO

2

培养箱、核酸蛋白检测仪（美国ThermoFisher公司），

青霉素、链霉素、胶原酶Ⅰ、卵清蛋白（OVA）、胰蛋白酶、尼日

利亚菌素钠盐、麝香酮（美国Sigma公司），弗氏完全佐剂

（CFA，上海碧云天生物技术有限公司），实时荧光定量聚合

酶链反应（qPCR）试剂盒（武汉优博生物技术有限公司），蛋

白定量试剂盒（上海易色医疗科技有限公司），TNF-α、IL-1β、

IL-6、TGF-β、CASP-1抗体（美国Proteintech公司），CASP-4、

CASP-5、消化道皮肤素D（GSDMD）抗体（美国SantaCruz公

司）。倒置显微镜（日本尼康公司），SDS-PAGE微型凝胶电泳

1.2.2

TianjinMedJ,August2021,Vol.49No.8

PBS中反复冲洗，剪开肠壁，清洗干净后，将肠壁剪碎，放入

胶原酶Ⅰ溶液（浓度1g/L），37℃水浴中振荡消化30min。反

复吹打消化混合物5min，1000r/min离心5min，去除上清

液，加入PBS，重悬浮组织沉淀物。重复相同条件离心处理3

次后，将重悬浮的细胞沉淀移入含有10%胎牛血清的DMEM

中进行培养，培养条件为37℃，5%CO

2

，饱和湿度。

1.2.3小鼠肠黏膜细胞促炎模型制备将上述对照组再分

肠黏膜细胞的获取与培养将取出的肠组织放入

为激活组和激活对照组，FPIES组再分为抑制组和抑制对照

组。激活组中加入尼日利亚菌素钠盐激活NLRP3蛋白表达，

按10nmol/L的终浓度处理24h。抑制组为麝香酮10nmol/L

处理24h抑制NLRP3蛋白表达。激活对照组和抑制对照组

均为溶剂DMSO处理24h。

1.2.4qPCR检测基因表达各组肠黏膜细胞均按照RNA提

取试剂盒的步骤提取细胞中的总RNA，并测定总RNA的浓

度。按照反转录试剂盒实验流程将提取的总RNA反转录为

cDNA，并进行PCR扩增。NLRP3引物：上游5′-GGCAA⁃

CACTCTCGGAGACAA-3′；下游5′-GGAAAGATCCCAGCAG⁃

CAGT-3′，产物大小126bp。GAPDH引物：上游5′-GT⁃

CAAGGCTGAGAACGGGA-3′；下游5′-GCCTTCTCCATGGT⁃

GGTGAA-3′，产物大小146bp。反应体系20μL：cDNA1μL，

上下游引物各1μL，GreenMix10μL，去离子水7μL。反应

条件：94℃2min；94℃10s，58℃15s，72℃10s，40个循

环。以GAPDH为内参，使用相对定量2

-ΔΔCt

法计算各细胞样

品中目的基因的相对表达水平。实验重复10次。

1.2.5Westernblot检测相关蛋白表达收集各组细胞，加入

哺乳动物蛋白抽提剂提取总蛋白。抽提后的细胞液在4℃，

12000r/min离心15min，收集上清液。按照蛋白定量试剂盒

的步骤，确定上清液中的蛋白浓度，然后用12%十二烷基硫

酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白。电泳完毕

后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，脱脂奶粉室

温封闭处理2h。加入目的蛋白的一抗抗体，包括炎性因子

CASP-4、CASP-5、GSDMD，4℃过夜。加入TBST缓冲液，包

NaCl8g、KCl8g、Tween-20为0.5mg、水1L，反复洗涤后，加

入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1.5h，再用

IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α和细胞焦亡标志分子CASP-1、

含1molpH7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TrisHCl）50mL、

及转膜设备（美国BIO-RAD公司），全自动化学发光图像分析

系统（上海天能科技有限公司），低温高速离心机（美国贝克曼库

尔特公司）。

1.2方法

1.2.1FPIES小鼠模型的建立配置致敏液，即2mg的OVA溶

解于100μL无菌PBS和100μLCFA中，存储质量浓度10g/L。

按随机数字表法将小鼠分为FPIES组和对照组，每组10只。

FPIES组注射致敏液200μL，此后每隔2d注射相同剂量致

敏液1次，共8次。第2周，以致敏液给小鼠灌胃，每隔2d灌

胃1次，共5次，OVA总量达到10mg/只。灌胃2周后断颈法

处死小鼠，取肠组织待用。采用不含OVA的PBS和CFA混合

液，以同样流程处理对照组。

TBST缓冲液洗涤3～4次，每次15min。将胶片放入显影液，

显影5min，采用化学发光法曝光，并用Gelpro软件进行条带

定量分析。实验重复10次。

1.3统计学方法采用SPSS20.0软件进行数据分析。计量

（x±s）

资料均采用均数±标准差表示，2组间比较采用成组t检

验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1FPIES组和对照组小鼠肠道黏膜细胞NLRP3及

炎症因子表达水平FPIES组肠黏膜细胞中NLRP3

mRNA（图1）和蛋白表达水平及IL-1β、IL-6、TGF-β、

TNF-α蛋白表达水平高于对照组（P＜0.01），见表1。

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831

2.3调控NLRP3对小鼠模型肠黏膜细胞的炎症

反应及细胞焦亡的影响激活组炎症因子IL-1β、

IL-6、TGF-β、TNF-α及细胞焦亡标志分子的CASP-1、

CASP-4、CASP-5、GSDMD蛋白水平较激活对照组

升高（P＜0.01），见表3。抑制组炎症因子TGF-β和

TNF-α蛋白水平较抑制对照组升高（P＜0.01），IL-1β、

IL-6及细胞焦亡标志分子的CASP-1、CASP-4、

CASP-5、GSDMD表达水平与抑制对照组比较差异

无统计学意义（P＞0.05），见表4。

3讨论

在FPIES患儿中，IgA和IgG抗体水平较低，保护

性抗体缺乏是该疾病的潜在特征

［5］

。FPIES患者外

周血TNF-α、IL-6和辅助型T细胞2（Th2）显著升

高

［6-7］

。NLRP3已经被证明是机体固有免疫的重要

组分，在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要

8］

作用

［4，

。由于能被多种类型的疾病信号激活，

NLRP3炎症小体在多种疾病发生过程中具有重要的

预警作用

［6］

。NLRP3可以通过核因子（NF）-κB信号

通路维持Th1/Th2平衡，同时NLRP3依赖性的

CASP-1也是IgA和IgG活化所必需的分子。本研究

建立FPIES的小鼠模型，并证实小鼠肠黏膜细胞中

NLRP3mRNA和蛋白水平，炎症因子IL-1β、IL-6、

TGF-β、TNF-α蛋白水平均较对照组升高，提示以

NLRP3为主的炎症反应参与FPIES的发生。本研究

证明，激活小鼠肠黏膜细胞中NLRP3表达可以显著

上调炎症因子与焦亡分子的表达水平；而在已经发

生炎症反应的FPIES小鼠肠黏膜细胞中，抑制

NLRP3的表达并不能改变IL-1β、IL-6和焦亡相关

分子的表达水平，提示NLRP3在炎症早期就激活了

重要炎症因子和焦亡分子。

FPIES患者肠道病变组织中有大量T细胞浸润，

Tab.1ExpressionlevelsofNLRP3andother

inflammatoryfactorsintwogroupsofmice

表12组小鼠的NLRP3及炎症因子的表达情况

x±s

）（n=10，

组别

对照组

FPIES组

组别

对照组

FPIES组

＊＊

NLRP3

mRNA

1.01±0.06

7.08±1.51

IL-6蛋白

12.701

＊＊

NLRP3蛋白

1.01±0.07

3.31±0.89

TGF-β蛋白

42.89±3.49

37.701

＊＊

1.16±0.19

8.104

＊＊

IL-1β蛋白

31.93±2.99

TNF-α蛋白

38.02±6.22

18.725

＊＊

1.16±0.19

32.640

＊＊

1.03±0.03

t

t

66.79±3.55

58.588

＊＊

1.03±0.03

P＜0.01

1000bp

800bp

600bp

400bp

200bp

Ladder对照组FPIES组

NLRP3（146bp）

Fig.1

图1NLRP3mRNA在2组小鼠中的表达情况

ExpressionlevelsofNLRP3mRNAintwogroupsofmice

2.2FPIES小鼠肠道黏膜细胞焦亡通路分子表达情

况FPIES组肠黏膜细胞CASP-1、CASP-4、CASP-5、

GSDMD表达水平高于对照组（P＜0.01），见表2。

Tab.2Expressionlevelsofproteinsrelatedto

pyroptosisintwogroupsofmice

表2

组别

对照组

FPIES组

＊＊

2组小鼠肠道黏膜中细胞焦亡相关分子的表达情况

x±s

）（n=10，

1.02±0.05

7.758

＊＊

CASP-1

1.02±0.05

9.229

＊＊

CASP-4

0.97±0.07

16.836

＊＊

CASP-5

0.96±0.08

GSDMD

t

26.98±3.3533.31±3.4955.97±10.3337.76±6.15

18.908

＊＊

P＜0.01

Tab.3EffectsofNLRP3activationontheexpressionlevelsofinflammatoryandpyroptosisproteinsintwogroupsofmice

x±s

）（n=10，

表3激活NLRP3对激活组和激活对照组炎症因子和细胞焦亡相关蛋白表达的影响

组别

激活对照组

激活组

＊＊

0.99±0.05

7.76±2.09

10.232

＊＊

NLRP3

t

25.45±5.04

15.364

＊＊

0.98±0.02

IL-1β

62.89±9.91

19.724

＊＊

1.05±0.05

IL-6

36.62±5.16

21.768

＊＊

1.11±0.03

TGF-β

40.28±9.41

13.207

＊＊

1.02±0.07

TNF-α

42.28±5.28

7.831

＊＊

1.11±0.13

CASP-1

40.28±3.55

11.055

＊＊

1.03±0.01

CASP-4

45.79±7.21

19.638

＊＊

1.06±0.02

CASP-5

44.75±8.22

16.816

＊＊

1.04±0.05

GSDMD

Tab.4EffectsofNLRP3inhibitionontheexpressionlevelsofinflammatoryandpyroptosisproteinsintwogroupsofmice

x±s

）（n=10，

表4抑制NLRP3对抑制组和抑制对照组炎症因子和细胞焦亡相关蛋白表达的影响

组别

抑制对照组

抑制组

＊

P＜0.01

0.93±0.01

143.494

＊＊

0.19±0.01

NLRP3

1.11±0.15

1.15±0.16

0.632

IL-1β

1.05±0.03

1.14±0.06

1.313

IL-6

1.13±0.08

1.62±0.16

2.659

＊

TGF-β

1.11±0.06

1.29±0.07

1.989

＊

TNF-α

1.19±0.09

1.27±0.07

0.674

CASP-1

1.05±0.05

1.17±0.07

1.310

CASP-4

1.11±0.05

1.31±0.12

1.673

CASP-5

1.08±0.05

1.16±0.11

0.684

GSDMD

t

＊＊

P＜0.05，P＜0.01

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832

伴随炎症因子水平升高，而炎症因子与细胞焦亡的

发生密切相关

［9］

，因此提示细胞焦亡可能参与FPIES

的发病。细胞焦亡是一种新的程序性细胞死亡方

式，其特征为依赖于炎性半胱天冬酶（主要是CASP-

1/4/5/11），并伴有大量促炎症因子的释放

［9］

。本研

究结果显示，FPIES组细胞焦亡相关的CASP-1、

CASP-4、CASP-5、GSDMD蛋白表达水平均升高。

其中，CASP-1介导细胞焦亡经典通路，而CASP-4、

CASP-5介导细胞焦亡非经典通路

［10］

，提示FPIES的

细胞焦亡的经典和非经典通路均被激活。此外，

NLRP3也已被证明与细胞焦亡的发生密切相关，

NLRP3介导炎症反应和细胞焦亡通路，参与FPIES

肠黏膜细胞的病理过程

［11-12］

。

NLRP3是机体内细胞监测异常信号的NOD样

受体（NLR）的重要亚型，发挥激活NLR表达，以及促

进炎症因子释放的双重作用，其调控异常会导致慢

性病的发生

［13］

。因其在疾病发生过程中属于早发的

信号分子，因此目前已经作为多种疾病诊断和治疗

的靶点，其中包括慢性免疫性疾病

［14］

、慢性疼痛

［15］

、

心血管疾病

［16］

、2型糖尿病

［17］

等。在胃肠道疾病的

研究中，抑制三重基序蛋白31（TRIM31）或含V-Set

免疫球蛋白域蛋白（VSIG4）可以活化NLRP3，缓解

葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎的严重程度，是结肠炎

治疗的潜在靶点

［18-19］

。本研究显示，NLRP3在

FIPES小鼠模型建立早期就出现活化表达，其通过

固有免疫和细胞焦亡通路参与FIPES病理过程，提

示NLRP3可能成为FIPES的潜在治疗靶点。

综上所述，NLRP3是FPIES黏膜细胞炎症反应

及细胞焦亡的上游调控分子，这为研究FPIES病理

机制提供了理论支持，也为该疾病的早期诊断与治

疗提供了新的潜在靶点。

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（本文编辑魏杰）

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