2024年5月12日发(作者：realmeq)

使用尼龙网做大量未成熟牛卵母细胞玻璃化的实验

H. Matsumoto, J. Y. Jiang, T. Tanaka, H. Sasada, E. Sato

对于卵母细胞和胚胎细胞的玻璃化技术最近通过新的物理技术的支持，例如电镜网格

法、开放式拉长塑料细管法、冷冻环法等方法有了提高。然而，每个容器中的样品数量往

往受到这些不同方法的限制。在最近的研究中，为了改进一种简洁新型的容器为做大量卵

母细胞和胚胎细胞玻璃化，我们检查了用尼龙网作为大量未成熟的卵母细胞和胚胎细胞玻

璃化的新型容器。结果显示，与原先1个网格只有15个卵冠丘复合体细胞的玻璃化容器

相比，用尼龙法做时多达65卵冠丘复合体能够被放置在尼龙网格上。尼龙法做的玻璃化

细胞在复苏率上高于电镜网格法，而受精率和生长率两者则没有明显的不同。这些结果表

明用尼龙法做玻璃化保存更加有效，而且提供了一种为大量卵母细胞冷冻保存的新的方法。

关键词：玻璃化、尼龙网法、电镜网格法、牛卵母细胞。

玻璃化保存现在已经被广泛的应用，而且被视作一种可以用作传统慢速程序冷冻（12）

的潜在选择方法。它的主要目的是最大限度的减少冰晶对细胞的损伤。当胚胎细胞被玻璃

化冷冻保存的时候，通过用高浓度的冷冻保护剂和高冷暖率来防止冰晶的产生。然而，大

多数玻璃化方法在冷却、储藏、复温时运用标准的塑料吸管法来固定细胞，但是这些塑料

吸管对于冷暖率的最大范围小于 2000℃/min。替代的方法可以用电镜网格法

（7,10,11） 、薄壁开放拉长的塑料吸管法 （16）或者冷冻环法（6） ，允许胚胎细胞

的培养基和液氮直接接触来提高已经发表过的冷暖率。有了这些方法，玻璃化步骤的成功

率得以提高。这些容器要求很小体积的胚胎细胞悬液（小于 1-2mL） 。然而，在电镜网

格法和开放式拉长塑料细管法中，每个容器中的样品数分别限制在10-15 和 4-6每格（冷

冻环法的限制数还没有报道过）。因此，这些方法不是非常适合用在大量卵母细胞和胚胎细

胞玻璃化的实验上。大量的牛卵母细胞可以在短时间内从屠宰场的子房中收集。为了适应

新的牛卵母细胞玻璃化保存技术，需要对实验的步骤多次重复。在玻璃化大量果蝇的胚胎

细胞时，需要用聚碳酸酯膜（12- 或者10-mm 孔径）（8,9）。一个过滤膜对于玻璃化大

量牛卵母细胞是非常有用的。然而，一个大孔径可以减少包含卵母细胞的溶液的体积，如

电镜网格（55-mm 网孔大小）和尼龙网法（60-mm 网孔大小）。在最近的研究中，我们

检查了用尼龙网（60-mm 网孔大小）作为玻璃化大量未成熟牛卵母细胞的新型容器。

牛卵母细胞从当地的屠宰场获得并且在一个小时内，在 37℃下运送到实验室的。卵

母细胞和积云细胞通过卵泡穿刺法收集到。收集到的 20-30 个 OCCs 被放进 100mL 包

含有 TCM 199 和 5%的牛犊胎儿血清的培养基中，并用矿物油盖好，置于5%CO2和

39℃的加湿环境下。未成熟的OCCs要在3小时内进行玻璃化。

一个薄的格子 T400H 网孔（55-mm网孔大小）（2720；日清时间，东京，日本）

被用作电镜网格法的固定格子。一个格子里可以装大约 10 到 15 的 OOCs。尼龙网，

60-mm 网孔大小（DIN100；瑞士赛发公司，罗什里空，瑞士），被用作固定的格子。尼

龙网被切成三角形，底和高分别是大约1.0和1.3cm。为了操作方便，纱包的涤纶线(0.2mm

直径)和尼龙网(Fig.1)系上。在使用前，EM 网格和尼龙网分别用用高压蒸汽灭菌法和同环

氧乙烷进行消毒。在这次研究中，OCCs 在每个尼龙网格上的数量大约是10-20或者

40-65。