2024年4月22日发(作者：gtx750ti为什么是神卡)

猫爪草皂苷对高转移肝癌细胞株 HCCLM3及 MHCC97-H

增殖的影响

刘帅;梁铁军;王爱武;高桂新

【摘 要】目的：观察猫爪草皂苷（ RRTS）对人高转移肝癌细胞株HCCLM3、

MHCC97-H增殖的影响。方法将对数生长期HCCLM3、MHCC97-H细胞分为两

组。 RRTS组分别采用50、100、200、400μg／mL浓度的RRTS干预，每浓度

5个复孔；5-FU组采用50μg／mL的5-FU干预，作用后72 h采用MTT法测定

两组细胞增殖情况，倒置显微镜下观察细胞形态变化。结果 RRTS组各浓度对

HCCLM3、MHCC97-H肿瘤细胞株的生长均有不同程度的抑制作用，随RRTS浓

度增加，抑制作用明显增强，呈量—效依赖关系（ P均＜0．05）；400μg／mL

对两种细胞的生长抑制率与5-FU组比较差异无统计学意义。倒置显微镜下观察，

两种细胞株经RRTS处理后，细胞密度降低，细胞相互分离，贴壁脱落，出现片状

无细胞生长区，并见细胞碎片，细胞变圆，体积减小，核固缩，核颜色加深，折光

性增强，随着RRTS剂量增加，这种变化更加明显。400μg／mL浓度的RRTS对

肿瘤细胞的生长抑制作用与5-FU组相似。结论RRTS对HCCLM3、MHCC97-H

细胞生长均有抑制作用。%Objective To study the effect of the saponins on

the HCCLM 3 and MHCC97-H proliferation of liver canc-er metastatic

cells .Methods HCCLM3 and MHCC97-H of high metastatic hepatocellular

carcinoma cell lines were used as the study object to detect the impact of

concentrations of the saponins on the growth of liver cancer cells by MTT

and a phase-contrast microscope was used to observe the impact of the

saponins on hepatoma cell morphology .Results The cell survival rate of

the saponins treatment group reduced compared with that of the control

group .This effect becomes more ob-vious with the increasing

concentration of the drug .The cell density reduced after the treatment of

the saponins through the observation under the Phase-contrast

microscope .Conclusion The saponins has an inhabitation effect on the

growth of HCCLM3 cells and MHCC97-H cells.

【期刊名称】《山东医药》

【年(卷),期】2015(000)006

【总页数】3页(P8-10)

【关键词】猫爪草;皂苷;肝细胞癌;HCCLM3细胞;MHCC97-H细胞;细胞增殖

【作 者】刘帅;梁铁军;王爱武;高桂新

【作者单位】山东中医药大学，济南250355; 山东大学附属省立医院;山东大学附

属省立医院;山东大学附属省立医院;山东大学附属省立医院

【正文语种】中 文

【中图分类】R735.7

据统计，肝癌在世界范围恶性肿瘤发病率中排第6位，病死率排第3位[1]。肝癌

具有高复发、高转移的特性，其治疗是世界性难题，肿瘤细胞转移是治疗失败的主

要原因[2～4]。抑制肝癌转移复发、延长患者生存期是目前临床上亟需解决的重要

课题[5，6]。猫爪草是临床上常用的抗肿瘤中药之一，现代药理学研究证实其有较

好的抗肿瘤活性。目前已有猫爪草皂苷(RRTS)抑制乳腺癌、结肠癌等的研究报道，

但其对肝癌细胞转移影响的相关报道鲜见。2015年4～5月，我们观察了RRTS

对人高转移肝癌细胞株体外增殖及细胞形态的影响。现报告如下。

1.1 材料 高转移肝癌细胞株 HCCLM3购于北京北纳创联生物技术研究院，高转移

肝癌细胞株MHCC97-H由山东大学附属省立医院中心实验室提供。药物及试剂：

猫爪草(毛茛科毛茛属植物小毛茛的干燥块根)由山东大学附属省立医院草药房提供，

5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)，二苯基四氮唑溴盐(MTT，美国AMRESCO公

司)，二甲基亚砜(DMSO，美国MP Biomedicals公司)，RPMI-1640(美国

Cellgro公司)，新生牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，0.25%胰蛋

白酶(美国Invitrogen公司)；青链霉素混合液(美国Invitrogen公司)。主要仪器：

Hera Cell 240型CO2培养箱(德国Heraeus公司)；IX71奥林巴斯倒置显微镜

(日本Olympus公司)；SpectraMax M2多功能酶标仪(美国Molecular Devices

公司)；SW-CJ-2FD医用型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；MDF-U53V

型医用低温箱(日本SANYO公司)；600A型医用低速离心机(安新县白洋离心机

厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 RRTS的制备 精密称取干燥的猫爪草100 g，粉碎成粗颗粒， 置回流提取器

中，用 85%乙醇提取 3次，提取液抽滤，经浓缩后分别用乙醚、水饱和正丁醇萃

取，水饱和正丁醇萃取液再用0.1 mol/L NaOH萃取2次，正丁醇液回收至干，

得总皂苷，将所得皂苷用适量蒸馏水溶解，G6 漏斗滤过除菌，4 ℃冰箱内保存备

用。

1.2.2 细胞培养 将HCCLM3、MHCC97-H细胞接种于RPMI-1640培养基[含10%

胎牛血清、1% 双抗(青霉素/链霉素) ],置于培养瓶中，于37 ℃、5% 的CO2恒温

孵育箱中培养、传代。

1.2.3 不同浓度RRTS对HCCLM3、MHCC97-H细胞增殖的影响的观察 采用

MTT法。取对数生长期HCCLM3、MHCC97-H细胞接种于96 孔板，每孔

5×103个细胞，培养24 h。RRTS组分别加入50、100、200、400 μg/mL浓度

RRTS， 每一浓度设5个平行孔，另设调零孔、空白对照孔；5-FU组加入5-FU

50 μg/mL。各组均培养72 h后加入MTT 溶液(用生理盐水配制) 20 μL( 5

mg/mL)培养，4 h后倒尽培养液，各孔加DMSO 150 μL， 轻轻振动后 室温置

30 min，用酶标仪(波长570 nm) 测定各孔的光密度(OD) 值，取每组平均OD 值，

计算细胞生长抑制率。抑制率(%) = (1-加药孔平均OD 值/对照孔平均OD

值)×100%。

1.2.4 不同浓度RRTS对HCCLM3、MHCC97-H细胞形态影响的观察 将对数生长

期的HCCLM3、MHCC97-H细胞消化，计数、接种于6孔板中，调整密度为

5×105/孔，待24 h细胞贴壁开始生长后换液，5-FU组加入50 μg / mL的 5-FU；

RRTS组分别加入50、100、200、400 μg/mL浓度的RRTS培养液。48 h后于

倒置显微镜下观察两组细胞形态。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。结果以±s表示，组间比较采用方差分

析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 RRTS对HCCLM3、MHCC97-H细胞株增殖的抑制作用 5-FU组和RRTS组

细胞抑制率见表1。由表1可见，50、100、200、400 μg/mL的RRTS对

HCCLM3、MHCC97-H生长均有不同程度的抑制作用，且随RRTS浓度增加，抑

制作用明显增强，呈量—效依赖关系，但RRTS组各剂量间比较差异有统计学意

义(P均<0.05)。400 μg/mL RRTS组对HCCLM3、MHCC97-H 肿瘤细胞的生长

抑制率与5-FU组比较差异无统计学意义。

2.2 RRTS对HCCLM3、MHCC97-H肿瘤细胞株形态的影响 倒置显微镜下可见，

RRTS组两种细胞株经RRTS处理48 h后，细胞密度降低，细胞相互分离，贴壁

脱落，出现片状无细胞生长区，并见细胞碎片，细胞变圆，体积减小，核固缩，核

颜色加深，折光性增强；随RRTS剂量增加，这种变化更加明显。400 μg/mL浓

度的RRTS对肿瘤细胞的生长抑制作用与5-FU组相似。

MHCC97-H细胞来源于肝癌患者的肝内播散灶，是通过逐级筛选获得的具有高转

移潜能的单克隆细胞株，符合一般肝癌的病理学和遗传学特征，具有我国肝癌细胞

的典型基本生物学性状。HCCLM3肝癌细胞株是以MHCC97-H 肝癌细胞株为基

础获得的高转移性肝癌细胞株[7]，具备肝癌细胞特点和良好的自发性转移特性[8]。

两种细胞株均是研究药物抑制肝癌细胞增殖、转移侵袭等细胞学实验的良好模型。

前期工作中我们采用系统溶剂法提取了RRTS，用MTT和SRB两种方法进行了

RRTS对人肺癌细胞株A549、人白血病细胞株HL-60及人宫颈癌细胞株Hela共

3种肿瘤细胞增殖影响的体外研究，结果证实RRTS有较好的抗肿瘤效果[9，10]。

猫爪草性味甘、辛、温，归肝、肺经，具有散结、消肿之功效，主治瘰疬结核、疔

疮、蛇咬伤等，民间主要用于治疗颈淋巴结核(俗称老鼠疮)、腮腺炎(俗称痒腮)；

猫爪草单、复方煎剂等对恶性淋巴瘤、甲状腺瘤、乳腺肿瘤、肺癌及妇科子宫肌瘤

等均有治疗效果。民间亦有人采用猫爪草治疗子宫颈癌，配白头翁治疗瘿瘤[11]，

配半枝莲、白英治疗胃癌、食道癌，配葶苈子治疗癌性腹水[12]。

本研究结果显示RRTS对高转移肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H增殖均有抑

制作用，并呈剂量依赖关系。倒置显微镜观察发现，RRTS可引起人高转移肝癌细

胞形态和颜色的改变以及成片脱落死亡，进一步证实了RRTS体外对高转移肝癌细

胞具有抑制作用。高于猫爪草抗肿瘤的机制目前尚不十分明确，但有较多报道。全

山丛等[15]认为其可能通过调节患者体内Cu/Zn平衡而发挥抗癌效果；周立等[16]

发现, 猫爪草中的软脂酸具有较强诱生肿瘤坏死因子(TNF)的作用；陈彦等[17]报道，

猫爪草中的多糖蛋白复合物RTG-Ⅲ能够诱导脾细胞分泌细胞因子，增强免疫细胞

对肿瘤细胞HL-60的抑制作用，推测猫爪草多糖通过增强宿主免疫系统的功能来

发挥抗肿瘤作用；孟祥虎等[18]推测高浓度RRTS可通过促进mfn2基因表达而抑

制MCF-7肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡；周清安等[19～21]认为RRTS具有明显抑

制人结肠癌LoVo细胞增殖和诱导凋亡作用，下调Bcl-2、Bcl-2/Bax，增加Bax、

Caspase-3 蛋白表达可能是其作用机制之一，其引起凋亡的途径可能与细胞内

Ca2+增加有关；童晔玲等[13]推测RRTS抑制A549细胞增殖机制可能与诱导凋

亡、G0/G1期阻滞有关；尹春萍等[22]认为RRTS体外抗肿瘤作用机制可能是通

过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制DNA的合成，抑制肿瘤细

胞的分裂。其他机制尚未见有研究报道。皂苷类成分复杂，RRTS中对人高转移肝

癌细胞株起抑制作用的确切的有效成分及其发挥作用的分子机制还有待深入研究。

【相关文献】

[1] Ferlay J， Shin HR，Bray F， et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:

GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010,127(12):2893-2917．

[2] Sun HC，Tang ZY. Preventive treatments for recurrence after curative resection of

hepatocellular carcinomar-A literature review of randomized control trials[J].

Gastroenterol，2003,9(4):635-640．

[3] 徐彦楠，周晨明，王彦玲，等. 细胞凋亡与肿瘤转移在肝癌中的作用[J].山东医药，2014,54(33)：

95-97.

[4] Olsen SK，Brown RS，Siegel AB. Hepatocellular carcinoma：review of current

treatment with a focus on targeted molecular therapies[J]. Ther Adv Gastroenterol,

2010,3(1):55-66．

[5] 吴孟超. 原发性肝癌的诊断及治疗进展[J]. 中国医学科学院学报，2008，30(4):363.

[6] 徐燕立，孟志强，刘鲁明. 中药抗肝癌复发和转移的实验研究进展[J].中华中医药杂志，2010，

25(10):1634-1637.

[7] Li Y，Tang Y，Ye L，et al. Establishment of a hepatocellular carcinoma cell line with

unique metastatic characteristics through in vivo selection and screening for metastasis-

related genes through cDNA microarray [J] . J Cancer Res Clin Oncol, 2003,129(1):43-51．

[8] 李雁，汤钊猷，叶胜龙，等．体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系[J]．中华医学杂

志，2002，82(9)：601-605．

[9] 王爱武，王梅，袁久荣． 猫爪草提取物体外抗肿瘤作用的研究[J]．天然产物研究与开发，

2004，16(6):529-531．

[10] 王爱武,袁浩,孙平玉.猫爪草不同提取物对移植性肝癌H22小鼠的抗肿瘤作用[J].中国新药杂

志,2006,l5(12):971-973.

[11] 蒋运祥. 猫爪草配伍应用举隅[J].浙江中医杂志，1989，24(6) ：275.

[12] 程建华, 李以槟. 抗癌植物及验方[M] .南昌: 江西科技出版社, 1998: 690.

[13] 童晔玲, 杨锋, 戴关海，等．猫爪草总皂苷体外抗人非小细胞肺癌A549细胞活性研究[J].中华

中医药学刊，2013，31(10):2181-2183.

[14] 王珂，汪爱勤，尹文，等. 原发性肝癌的治疗进展[J].山东医药，2014,54(43)：88-90.

[15] 全山丛，汪学昭，郑汉臣，等. 中药猫爪草的微量元素分析[J].微量元素与健康研究, 1997,

14(2):29-30.

[16] 周立, 张炜, 许津. 猫爪草有效成分诱生肿瘤坏死因子的作用[J].中国医学科学院学报, 1995,

17(6):456-460.

[17] 陈彦,戴玲,沈业寿. 猫爪草多糖RTG-Ⅲ的分离纯化及其生物活性[J].中国药学杂志，2004,39(5)：

339-342.

[18] 孟祥虎，刘博，尹春萍，等．mfn2基因在猫爪草皂苷、红三叶异黄酮治疗乳腺癌中的作用机

制研究[J].中国药师， 2011，14(9)：1243-1246.

[19] 周清安，余海滨.猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞增殖和凋亡影响的研究[J].辽宁中医药大学学

报，2009，11(4)：190-192．

[20] 周清安，余海滨.猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞凋亡和线粒体电位的影响[J].中华中医药学刊，

2009，27(5)：1079-1081．

[21] 周清安，余海滨．猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞凋亡和细胞内Ca2+浓度的影响[J]．河南中

医学院学报，2009，24(1):29-34．

[22] 尹春萍，樊龙昌，张立冬，等．猫爪草皂苷抑制乳腺癌的机制研究[J].中国医院药学杂志，

2008，28(2)：93-96．