2024年3月12日发(作者：暖暖 日本 高清 在线观看8)

・３２・　黑龙江医药科学２０１１年２月第３４卷第１期　

恩诺沙星　一环糊精包合物的制备　

于莲　，胡海权。，张玉　

（１．佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯１５４００７；２．哈尔滨市华农威普动物保健品有限公司，黑龙江哈尔滨１５００２５）　

摘要：目的：探讨恩诺沙星ｐ一环糊精包合物的制备工艺并对制剂进行质量考察。方法：采用饱和水溶液法制备恩诺沙星Ｂ　

一

环糊精包合物，通过Ｌ。（３　）正交试验设计，以药物的包封率为考察指标，综合评定后确定最佳制备工艺。结果：最佳包合条　

件恩诺沙星与ｐ一环糊精比例为１：３、包合时间为１．５ｈ、包舍温度为６Ｏ℃，平均包封率为５０．０１　。经差示扫描量热分析表明饱　

和水溶液法制备的恩诺沙星与８一环糊精形成包合物。结论：饱和水溶液法制备恩诺沙星Ｂ一环糊精包合物，方法简单、包封率　

较高、可操作性强。本课题为进一步研究恩诺沙星Ｂ一环糊精包合物提供了依据。　

关键词：恩诺沙星；８一环糊精；包舍物；正交试验　

中图分类号：ＴＱ４６文献标识码：Ａ文章编号：１００８一Ｏ１０４（２０１１）０１—００３２—０２　

ｐ一环糊精及其衍生物是近年来发展起来的新型药物包　一２型电子恒温水浴锅（苏州威尔实验用品有限公司）；７９—１　

合材料．有很多优点：提高药物的生物利用度；提高在制剂过　型磁力加热搅拌器（山东邺城华鲁电热仪器公司）。　

程中或在投药部位的稳定性；掩盖药物的不良臭味和降低刺　１．２　试剂　

激性等　］，在生物医学领域中受到极大的重视和广泛应用。　

恩诺沙星又名乙基环丙沙星，为第一个畜禽专用的氟喹诺酮　

氯仿（ＡＲ，天津市宏顺化工有限公司）；氢氧化钠（ＡＲ，　

类药物，具有抗菌谱广、杀菌活性强、体内分布广泛、与其它　

天津市广成化学试剂有限公司）；Ｂ一环糊精（ＣＰ，孟州市华兴　

抗菌药物无交叉耐药性等特点［２］，现已广泛应用于兽医临　

生物化工有限公司）；恩诺沙星（纯度≥９８　，新昌朗博药　

床『３］。实验通过恩诺沙星ｐ一环糊精包合物的制备研究，以寻　

业）。　

找掩盖恩诺沙星苦味的包合物工艺条件，提高药物的稳定　

２　方法与结果　

性，从而更好的应用于动物疾病的治疗当中。　

２．１　含量测定　

１　仪器与试药　

精密称取包合物０．１ｇ，置于５ＯｍＬ容量瓶中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ　

１．１　仪器　

氢氧化钠定容，摇匀后精密吸取５ｍＬ于５０ｍＬ容量瓶中，用　

Ｓ一５４型紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司）；　

０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠稀释至刻度，紫外分光光度法测其在　

ＧＺＸ一９１４０　ＭＥＢ型电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有　

２７１ｎｍ处的吸光度值，记为Ａ，将其代入标准曲线方程，计算　

限公司）；ＤＴＡ　４０４　ＰＣ高温差热分析仪（德国耐驰公司）；　

含量。　

ＦＡ２００４型电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；ＨＨ　

（上接第３１页）　

的新生物。肿瘤的发生与细胞凋亡失衡、细胞的异常增生、分　

参考文献：　

化停滞有关。细胞凋亡与细胞增殖密切相关。增生过度、凋亡　

［１］江纪武，肖庆祥．植物药有效成分手册［Ｍ］．北京：人民卫生出版　

减少和细胞去分化都有助于肿瘤的形成和发展。不能维持细　

社，１９８６，７８６　

胞数量的适当平衡是肿瘤的一个特征。肿瘤学家们以往关注　

［２］Ｋｅｒｒ　ＪＦ，Ｗｙｌｌｉｅ　ＡＨ，Ｃｕｒｒｉｅ　ＡＲ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａ　ｂａｓｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｈｅ—　

的首先是细胞的增殖，自从１９７２年，Ｋｅｒｒ等人［２　提出了凋亡　

ｎｏｍｅｎｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｗｉｄｅ　ｒａｎｇｉｎｇ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　

并对其特征加以描述后，研究者们就开始对凋亡的形态、基　

Ｃａｎｃｅｒ，１９７２，２６：２３９－５７　

因表达调控［３　］以及凋亡与疾病Ｉｓ］等方面展开了研究，发现　

［３１李奎，刘英，康相涛．主要凋亡基因对细胞凋亡的调控［Ｊ］．解剖科　

凋亡调节紊乱可导致肿瘤、神经退行性变或自身免疫性疾病　

学进展，２００７，ｌ３（１）：６２—６５，７０　

［４］Ｗａｊａｎｔ　Ｈ．Ｔｈｅ　Ｆａｓ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ：ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　ａ　ｐａｒａｄｉｇｍ［ｊ］．　

等多种疾病。本研究采用体外细胞培养法观察了ＯＡ对宫颈　

Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６（５５７３）：ｌ６３５－１６３６　

癌Ｈｅｌａ细胞增殖的影响，初步探讨其在宫颈癌Ｈｅｌａ细胞中　

［５］Ｂｒｅｎｎｅｒ　Ｃ，Ｋｒｏｅｍｅｒ　Ｇ，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｔｈｅ　ｄｅａｔｈ　ｓｉｇｎａｌ　ｉｎ—　

的作用机制。由于宫颈疾病局部给药方便并效果更好，所以　

ｔｅｇｒａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８９（５４８２）：８１０－８１６　

开发研制出适合局部治疗的０Ａ剂型，能更好的用于宫颈癌　

ｒ６］Ｎｉｅｈｏｌｓｏｎ　ＤＷ．Ｆｒｏｍ　ｂｅｎｃｈ　ｔｏ　ｃｌｉｎｉｃ　ｗｉｔｈ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ—ｂａｓｅｄ　ｔｈｅｒａ—　

的辅助治疗。　

ｐｅｕｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７（６８０５）：８１０－８１６　

（收稿日期：２ＯｌＯ—Ｏ９—２７）　

作者简介：王晶（１９８４￣）女，内蒙古人，硕士研究生。　

通讯作者：张涛，女，教授，硕士生导师，Ｅ—ｍａｉ１：ｚｔｌｚｙ８８８＠１６３．ＣＯ１ＴＩ．　

Ｅｆｆｅｃｔ　０ｆ　ｏｌ　ｅａｎｏｌ　ｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　Ｈｅｌ　ａ　ｃｅｌ　Ｉ　ｓ：Ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　

Ｗ　ＡＮＧ　Ｊｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｔａｏ，ＳＨＡＮＧ　Ｙｎｎ一　ｔ　

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｏｆ　Ｊｉａｍｕｓｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｍｕｓｉ　１５４００７，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａ—　

ｎｉｓｍ　ｔｈａｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ａｎ　ａｔｔｅｍｐｔ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｄａｔａ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　

ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　

ｆｏｒ　２４ｈ，４８ｈ　ａｎｄ　７２ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌ　ｔｓ：　

Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ　ａｎｄ　ｔｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：　

０ｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｔｓ　ｂｌｏｃｋａｇｅ　ｏｆ　ｅｅｌｌ　ｃｖ－　

ｃｌｅ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ；ｏｌｅａｎｏｌｉｅ　ａｃｉｄ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　

ＨＥＩＬ０ＮＧＪＩＡＮＧ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＹ　Ｆｅｂ．２０１　１。Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．１　・３３・　

２．２　恩诺沙星包封率的测定　

在上述包合物中恩诺沙星含量测定的基础上，按包封率　

公式计算包合物的包封率。包封率计算公式：包封率＝恩诺　

沙星含量／包合物实际重量×１００　。　

２．３　包合物的制备　

采用饱和水溶液法制备恩诺沙星包合物。取１ｇ恩诺沙　

星，用少量０．Ｉｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶解。另称取４ｇ　ｐ一环糊精加　

８７ｍＬ蒸馏水在４０℃水浴锅中制成饱和溶液，在磁力电动搅　

——————　—Ａ　

Ｂ　

Ｏ　

Ｄ　

１００　１５０　２００　２５０　

拌下，将恩诺沙星溶液缓慢滴入到ｐ一环糊精饱和溶液中，恒　

温搅拌３０ｍｉｎ停止加热，继续搅拌至室温，得白色混悬液，置　

冰箱中冷藏２４ｈ后，抽滤，用少量氯仿洗涤３次，６０　Ｃ干燥即　

得。　

Ａ恩诺沙星　Ｂ　ｐ一环糊精Ｃ恩诺沙星与ｐ一环糊精混合物　

Ｄ恩诺沙星与口一环糊精包合物　

图ｌ样品差示扫描量热曲线　

２．４　正交试验优化处方工艺　

从ＤＳＣ图看出，恩诺沙星在２１６　Ｃ出现一吸热峰，ｐ一环　

在前期单因素考察的基础上，选定３因素３水平，按Ｌ。　

（３　）正交试验设计表设计实验，以包封率Ｅ　为评价指标对　

各个处方进行评价，以回收率Ｒｅ　和药物的含量Ｐ　综合优　

化最佳处方工艺，因素水平见表１，正交试验结果分析见表２。　

表Ｉ　正交试验因素水平表　

糊精在１１９　Ｃ出现一吸热峰，为水分蒸发峰，物理混合物虽有　

微弱的相互作用，但只是简单的混合而没有形成新的物质．　

包合物ＤＳＣ曲线中恩诺沙星熔点峰消失，说明恩诺沙星和Ｉ３　

环糊精已形成包合物。　

～

３　讨论　

由含量测定可得出，恩诺沙星Ｂ一环糊精包合物的制备　

时，氢氧化钠用量不宜太多，因为氢氧化钠用量多，可使溶剂　

疏水性增加．从而使恩诺沙星只溶解于溶剂中而无法进入Ｂ　

环糊精所提供的疏水腔道以形成包合物。恩诺沙星Ｂ一环　

糊精包合物紫外吸收扫描证明，恩诺沙星主药未发生化学变　

～

化，是通过物理包合作用形成的包合物，对包合物的熔点测　

定证明，包合物与恩诺沙星及混合物不同，已形成了新的物　

相。该研究采用饱和水溶液法制备了恩诺沙星ｐ一环糊精包　

合物。所用药剂辅料来源广泛，价格低廉，制备成本较低．通　

过正交试验设计优选了制备工艺条件，该工艺简便易行，重　

复性好，有效的掩盖了药物的苦味，便于工业化生产。　

参考文献：　

［】］Ｓｏｎｇ　Ｌ，Ｐｕｒｄｙ　Ｗ　Ｃ．Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｎａｌｙｔ—　

从表２可以看出，影响恩诺沙星口一环糊精包合物包封率　

的因素依次为Ａ＞Ｃ＞Ｂ，即药物与包合材料的比例影响最　

大，其次是搅拌时间，温度因素的影响相对较小。结合Ｋｉ水　

平及回收率、药物含量测定结果，最终选择Ａ　Ｂ　Ｃ　条件为最　

佳工艺条件，即恩诺沙星与ｐ一环糊精投料比为Ｉ：３、包合温　

度６ＯＣ、搅拌时间１．５ｈ，按此工艺条件进行重复试验得到包　

封率为５１．Ｏ１　、药品含量为４６．１２　、品回收率为９５．７０　。　

２．５　恩诺沙星８一环糊精包合物的差示热分析　

恩诺沙星、ｐ一环糊精及恩诺沙星Ｂ一环糊精混合物、恩　

诺沙星ｐ一环糊精包合物（后两者含有恩诺沙星、８一环糊精　

量与前两者相等）４种物质进行差示热分析扫描（扫描速度为　

２０Ｃ／ｍｉｎ。升温速度为５　Ｃ／ｍｉｎ，温度范围为５Ｏ～２７５　Ｃ），扫　

描结果见图１。　

ｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ　Ｒｅｖ，ｌ９９２，９２（１０）：１４５７—１４５８　

［２］应翔字，钣朗．兽用新型抗菌药物恩诺沙星［Ｊ］．中国兽药杂志，　

１９９５，２９（３）：５３－５６１　

［３］Ｖａｎｅｕｔｓｅｍ　Ｐ　Ｍ，Ｂａｂｉｓｈ　Ｊ　Ｇ，Ｓｃｈｗａｒｋ　Ｗ　Ｓ．Ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ　

ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，　

ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｖｅｔ，１９９０，　

８０（２）：１７３－１８６　

［４］陆彬．药物新剂型与新技术［Ｍ］．北京：人民卫生出版杜．Ｉ９９８，２４　

５２　

（收稿Ｈ期：２０１０一Ｏ７—２０）　

作者简介：于莲（１９６１～）女，黑龙江佳木斯人，教授，学士，研究方向：靶向制剂研究。　

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｒｏｆｌ　ｏｘａｃｉｎ　ｐ—ｃｙｃｌ　ｏｄｅｘｔｒｉｎ　ｉｎｃｌ　ｕｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｌ　ｅｘ　

ＹＵ　Ｌｉａｎ　，　Ｈａｉ—ｑｕａｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ　

（１．Ｐｈａｒｍａｃｙ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｊｉａｍｕｓｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｍｕｓｉ　１５４００７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｕａｎｏｎｇ　Ｗｉｌｌｈｏｐｅ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００２５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　３－ｃｙｃｌｏｄｅｘ—　

ｔｒｉｎ（ＥＮＲ一　一ＣＤ）ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｉｔｓ　ｑｕａｌｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＥＮＲ一０一ＣＤ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　

ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｙ　Ｉ　９（３　）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ，ｗｉｔｈ　ｄｒｕｇ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　

ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｓ　ｉｎｄｅｘ．ＲｅｓｕＩ　ｔｓ：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ　

ｗｅｉｇｈｔ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ａｎｄ　８一ＣＤ　ｗａｓ１：３，ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　６０℃ａｎｄ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　１．５ｈ．　

Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｗａｓ　５０．０１　．Ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　

ＥＮＲ—ｐ—ＣＤ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＤＳＣ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＥＮＲ—　—ＣＤ　ｉｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｓｏｌｕ—　

ｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　

ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ＥＮＲ—ｐ—ＣＤ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：：ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ；７－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ；ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ