2024年4月13日发(作者：)

蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳

一 目的

掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法

二 原理

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，

使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基

乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。

因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，

解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了

蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也

基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。

基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分

子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，

制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从

标准曲线得到相应的分子量

三 试剂和器材

试剂：1低分子量标准蛋白质

2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液）

3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗

处贮存，一个月内使用

4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水

定容至1000ml

5 10%(w/v)SDS

6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配）

7 四甲基乙二胺（TEMED）

8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g， 溶于蒸馏水并定容至1000ml,

使用时稀释10倍。

9 2×样品稀释液： SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油 3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL

(pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保

存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。

10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml

11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml

12 染色液： 0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中

器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽

四 操作步骤

1分离胶制备：

凝胶浓度

凝胶贮液ml

1mol/LPH8.8 Tris-HClml

水 ml

10% SDS ml

10% 过硫酸铵 ml

TEMED (

μL

)

5%

5

11.2

13.7

7.5%

7.5

11.2

11.2

10%

10

11.2

1.2

0.3

0.1

20

12.5%

12.5

11.2

8.7

15%

15

11.2

3.7

将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形

成凹槽处处平齐，而后插入“加样梳”，在室温下放置1小时左右，分离胶即可完全凝集。

凝聚后，慢慢取出“加样梳”，取出时应防止把加样孔弄破，取出“加样梳”后，在形成的

加样孔中加入蒸馏水，冲洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加样孔中的蒸馏水后，在加入已稀释的

电极缓冲液。

2, 样品制备：

标准蛋白质制备

待测蛋白样品制备：

液体待测样品，可取500

μL，加入等体积的“

2×样品稀释液

”，混匀，在沸水浴中加热5min,

取出，冷却至室温备用。若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。

3，点样

用微量进样针吸取上述蛋白质样品20

μL分别加入到各个加样孔中，为了获得准确的结果，每

个样品应做两次重复。

4，电泳

将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液，打开电源，选择合适电压，

保持恒电压300V，进行电泳，直至样品中燃料迁移至离下端1cm处，停止。

5，固定，染色，脱色

将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝

胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色

至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。

凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。

淀粉酶活性电泳

浓缩胶（单板）：

水：1.8ml 凝胶贮液：0.5ml PH6.8缓冲液：0.78ml

10%SDS :34μL TEMED:30μL 10%AP:25μL

上样要少，4μL即可；

电泳完毕后，胶用清水冲洗两遍，再用2mol/l Tris溶液浸泡1h；

蒸馏水洗干净，倒入1%淀粉溶液，震荡水浴锅中，37°反应10min；

取出，加入碘-KI（0.2%：2%）溶液显色；

灯箱观察拍照。

糖电泳

电极缓冲液

0.09 MTris

0.08M硼酸

2.6mMEDTA

胶

7.5ml凝胶贮液

15ml贮液

7.5ml水

TEMED 60 微升

10%AP 90微升

贮液