2024年2月8日发(作者：)

・2218・7　FinkJ,SandersK,RipplA,etal1Celltype2dependenteffectsofpolo2likekinase1inhibitioncomparedwithtargetedpoloboxinterferenceincancercelllines〔J〕1MolCancerTher,2007;6(12Pt1):318929718　BrotherickI,ShentonBK,EganM,etal1Examinationofmultidrugresist2anceincelllinesandprimarybreasttumoursbyflowcytometry〔J〕1EurJ中国老年学杂志2009年9月第29卷Cancer,1996;32A(13):23342411〔2009206203收稿　2009207210修回〕(编辑　曲　莉)新分离枯草芽孢杆菌蛋白酶基因的克隆和鉴定郑永晨　黄　颖　钟莉莉　张　堃　曹　岩　(吉林大学第二医院中心实验室,吉林　长春　130041)　　〔摘　要〕　目的　从新分离的枯草芽孢杆菌中克隆和鉴定蛋白酶基因。方法　用PCR方法从新分离的枯草芽孢杆菌DNA扩增出蛋白酶基因,PCR产物克隆入pMD218T载体,DNA序列分析鉴定重组的插入片段;DNA序列分析结果与GenBank上的序列进行比较确定新克隆蛋白酶基因的种类。结果　从枯草芽孢杆菌DNA中扩增出大约1200bp的PCR产物,重组入pMD218T载体,DNA序列分析结果显示插入的DNA片段全长1146个核苷酸,在Genbank搜索显示为枯草芽孢杆菌蛋白酶基因全序列,与GenBank报道的所有序列均有差别。结论　从新分离的枯草芽孢杆菌DNA中克隆出新的蛋白酶基因。〔关键词〕　枯草芽孢杆菌;蛋白酶〔中图分类号〕　Q93919　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　100529202(203CloningandidentifyingaproteasegenefromanovelBacillussubtilisZHENGYong2Chen,HUANGYing,ZHONGLi2Li,etalCenterLaboratory,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,Jilin,China【Abstract】　Objective　TocloneandidentifyaproteasegenefromanovelBacillussubtilis1Methods　Theproteasegenewasam2plifiedfromDNAofanovelBacillussubtilisbyPCR1ThePCRproductwasinsertedintopMD218TvectorwhichwasidentifiedwithDNAse2quence1TheresultsofDNAsequencewasmatchedwiththesequencesinGenBankforidentifyingthegene1Results　AfragmentofPCRproductabout1200bpwasamplified,andthePCRproductwasrecombinedintopMD218T1Sequencingtherecombinantvectorshewthattheinsertedfragmentwas1146bpwhichwasproteasegeneofBacillussubtilis,butitwasdifferentfromallofreportedsequenceinGenBank1Conclusions　AnewproteasegeneisclonedandidentifiedfromanovelBacillussubtilis1【Keywords】　Bacillussubtilis;Protease　　老年人随增龄易出现心脑血管疾病〔1〕,纤溶酶和其激活剂可以预防和治疗血栓性疾病。自然界中枯草芽孢杆菌种类繁多,各类菌种均有各自的特点,其中有些芽孢杆菌可产生多种蛋白酶〔2〕扩增产物为包括蛋白酶的完整基因序列。112　方法11211　细菌培养和DNA提取　CC2菌接种于510ml的液体LB培养中37℃振荡培养410h,离心回收菌体,用细菌DNA提,而有些蛋白酶具有溶解纤维蛋白的作用,其中纳豆〔3～5〕菌产生的纳豆激酶则具有溶解血栓的功能以药用的蛋白酶具有非常重要的意义。1　材料与方法。因此,探索自取试剂盒提取DNA。11212　PCR扩增蛋白酶基因　PCR体积50μl,其中包括10然界不同芽孢杆菌蛋白酶基因的差别和酶蛋白的性质,寻找可倍的缓冲液510μl,dNTP410μl(215mmol/L),引物NA1和NA2各110μl(各100ng),模板DNA210μl,TaqDNA聚合酶015μl(215U),蒸馏水3615μl;混匀,置PCR仪扩增,94℃110min;55℃110min;72℃310min,循环30个周期,补充72℃510min。PCR产物于110%的琼脂糖凝胶上电泳,切下PCR产111　材料　芽孢杆菌(CC2菌)是本室从长白山区土壤中分离的菌种,已经用细菌16SRNA基因序列分析确定为枯草芽孢杆菌;TaqDNA聚合酶、dNTP、细菌DNA提取试剂盒、pMD218T载体、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,质粒DNA提取试剂盒、大肠杆菌JM109、DNA标尺DL22000(大连TAKARA公司);蛋白胨和酵母粉(OXOID);根据GenBank纳豆激酶基因序列设计一对引物,NA1:5′2ATGAGAAGCAAAAAATTGTGG23′,NA2:5′2(上海生工生物公司合成),TTATTGTGCAGCTGCTTGTACG23′物条带,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA。11213　PCR产物TA克隆　取410μl纯化的PCR产物,加110μ的lT载体和510μl的连接液,混匀,置4℃过夜,连接液转化200μl感受态JM109,于含氨苄青霉素的LB培养基上筛选,挑取阳性菌落,液体扩大培养,提取质粒鉴定。委托大连TAKARA公司进行双向DNA序列分析。2　结　果211　PCR基因扩增结果　CC2菌基因组DNAPCR扩增结果基金项目:吉林省发展改革委员会基金(2005)第一作者:郑永晨(19592),男,博士,主要从事分子生物学研究。

郑永晨等　新分离枯草芽孢杆菌蛋白酶基因的克隆和鉴定　第17期・2219・见图1,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物大约为1200bp。212　CC2菌蛋白酶基因序列比较结果　CC2菌蛋白酶基因测个氨基酸的差别。见图2。序结果显示基因全长1146bp,包括启始密码子和终止密码子,编码381个氨基酸的开放读码框架;GenBankBLAST搜索,结果表明CC2菌的蛋白酶基因序列与枯草芽孢杆菌YF038纳豆激酶基因同源性最高(GenBank:AY21990111)〔6〕,仅有2个核苷酸的差别,分别是278位的G→A和873位的T→C核苷酸变化,由此产生密码子和氨基酸的变化,分别是AGC→AAC的丝氨酸变为天冬酰胺;GTA→GCA的缬氨酸变为丙氨酸。CC2菌蛋白酶基因序列与枯草芽孢杆菌DTQ2DR23蛋白酶基因比较有3个核苷酸差别(GenBank:EF06145611),分别是278位(G→A)、510位(T→C)和513位(C→T),但是510和513位的核苷酸变化没有改变编码的氨基酸,因此,CC2菌的蛋白酶基因编码的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌DTQ2DR23蛋白酶仅有11:CC2菌的PCR产物;2:DNA标尺DL22000图1　PCR基因扩增产物电泳结果ATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATG60GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATG60GCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAGAAATACATT120GCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAGAAATACATT120GTCGGATTTAAGCAGACAATGAGTGCCATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCT180GTCGGATTTAAGCAGACAATGAGTGCCATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCT180GAAAAAGGCGGAAAGGTTCAAAAGCAATTTAAGTATGTTAACGCGGCCGCAGCAACATTG240GAAAAAGGCGGAAAGGTTCAAAAGCAATTTAAGTATGTTAACGCGGCCGCAGCAACATTG240GATGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGATCCGAACGTTGCATATGTGGAAGAAGAT300GATGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAAGAT300CATATTGCACATGAATATGCGCAATCTGTTCCTTATGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCG360CATATTGCACATGAATATGCGCAATCTGTTCCTTATGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCG360GCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGA420GCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGA420ATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTTCCTTCTGAA480ATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTTCCTTCTGAA480ACAAACCCATACCAGGACGGCAGTTCTCACGGTACGCATGTCGCCGGTACGATTGCCGCT540ACAAACCCATACCAGGACGGCAGTTCTCACGGTACGCATGTCGCCGGTACGATTGCCGCT540CTTAATAACTCAATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCAGTAAAA600CTTAATAACTCAATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCAGTAAAA600GTGCTTGATTCAACAGGAAGCGGCCAATATAGCTGGATTATTAACGGCATTGAGTGGGCC660GTGCTTGATTCAACAGGAAGCGGCCAATATAGCTGGATTATTAACGGCATTGAGTGGGCC660ATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCTACTGGTTCTACAGCG720ATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCTACTGGTTCTACAGCG720CTGAAAACAGTAGTTGATAAAGCGGTTTCCAGCGGTATCGTCGTTGCTGCCGCAGCCGGA780CTGAAAACAGTAGTTGATAAAGCGGTTTCCAGCGGTATCGTCGTTGCTGCCGCAGCCGGA780AACGAAGGTTCATCCGGAAGCACAAGCACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACT840AACGAAGGTTCATCCGGAAGCACAAGCACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACT840ATTGCAGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCCAGCGCAGGTTCT900ATTGCAGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCCAGCGTAGGTTCT900GAGCTTGATGTAATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTAC960GAGCTTGATGTAATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTAC960GGCGCTTATAACGGAACGTCCATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGAGCAGCAGCGCTAATT1020GGCGCTTATAACGGAACGTCCATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGAGCAGCAGCGCTAATT1020CTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCA1080CTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCA1080ACATACCTTGGAAGCTCTTTCTACTATGGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCA1140ACATACCTTGGAAGCTCTTTCTACTATGGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCA1140CAATAA1146CAATAA1146　　CC2菌蛋白酶基因的第一个核苷酸是引物设计时引入的A图2　CC2菌蛋白酶基因序列(上行);枯草芽孢杆菌YF038纳豆激酶基因序列(下行)

・2220・中国老年学杂志2009年9月第29卷3　讨　论　　枯草芽孢杆菌广泛分布于自然界,其有很多菌种,不同地区分离的菌在基因结构上有许多差异。枯草芽孢杆菌可以产生许多酶类,已对枯草芽孢杆菌进行了全基因序列分析〔2〕。特别是枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶,广泛地应用于食品、化工、医药、洗涤剂和制革业等〔7〕。中国和日本等国家的传统发酵食品中能分离到枯草芽孢杆菌,从日本的传统食品纳豆中分离到的纳豆菌产生的纳豆激酶在体内外均具有溶解纤维蛋白的作用〔3,4〕。因此,纳豆激酶有成为溶栓药物的可能。但是,不同菌种产生的蛋白酶类有很多区别,特别是基因序列很小的变化可以改变蛋白酶的很多性质,所以从天然的样品中分离和筛选新的枯草芽孢杆菌和其产生的蛋白酶类非常有意义。　　CC2菌是经细菌16SRNA基因序列分析证明的一种枯草芽孢杆菌,根据纳豆激酶基因序列设计引物和PCR扩增得到与纳豆激酶基因非常相似的基因,GenBankBLAST分析表明CC2菌蛋白酶基因与枯草芽孢杆菌YF038纳豆激酶基因序列4　参考文献1　LazziniA,LazziniS1Cardiovasculardisease:aneconomicalperspective〔J〕1CurrPharmaceuticalDesign,2009;15(10):114225612　KunstF,OgasawaraN,MoszerI,etal1Thecompletegenomesequenceofthegram2positivebacteriumBacillussubtilis〔J〕1Nature,1997;390(6657):24925613　PengY,HuangQ,ZhangRH,etal1PurificationandcharacterizationofafibrinolyticenzymeproducedbyBacillusamyloliquefaciensDC24screenedfromdouchi,atraditionalChinesesoybeanfood〔J〕1CompBio2chemPhysiolPartB,2003;134:4525214　SumiH,HamadaH,TsushimaH,etal1Anovelfibrinolyticenzyme(nat2tokinase)inthevegetablecheeseNatto,apopularsoybeanfoodintheJapanese〔J〕1DietExperientia,1987;43(10):111021115　SumiH,HamadaH,NakanishiK,etal1Enhancementofthefibrinolyticactivityinplasmabyoraladministrationofnattokinase〔J〕1ActaHaema2tol,1990;84(3):13924316　LiangX,JiaS,SunY,etal1SecretoryexpressionofnattokinasefromBa2cillussubtilisYF38inEscherichiacoli〔J〕1MolBiotechnol,2007;37(3):18729417　SudhirKR,AshisKM1EcologicalsignificanceandsomebiotechnologicalapplicationofanorganicsolventstablealkalineserineproteasefromBa2cillussubtilisstrainDM204〔J〕1BioresourTechnol,2009;100(9):26422451仅有2个核苷酸差别,两者均产生编码的氨基酸变化;而与枯草芽孢杆菌DTQ2DR23蛋白酶基因比较有3个核苷酸差别,但是仅有1个编码的氨基酸变化,因此CC2菌的蛋白酶基因编码的蛋白质与DTQ2DR23蛋白酶最相似。GenBankBLAST搜索分析发现与CC2菌蛋白酶基因相似的序列很多,但是其他序列均有2个以上氨基酸的差别。CC2菌蛋白酶基因产生的突变是否影响到蛋白酶性质的变化,需要进一步研究蛋白酶的活性等性质。枯草芽孢杆菌是自然界变异很快的细菌〔2〕〔2009203216收稿　2009204210修回〕,因此菌体编码的基因序列也在不断的变化,所以从天然样品中分离菌种,克隆相关的基因,获得更多的基因信息非常有意义。(编辑　徐　杰/胡国义)欢迎订阅《中国老年学杂志》(ISSN10052《中国老年学杂志》9202,CN2221241/R)为中国老年学学会会刊,是中国创刊较早,惟一囊括老年医学、老年生物学、老年心理学和老年社会学的老年学综合性学术期刊。主要刊载老年医药学(基础与临床医学研究、流行病学、药学、中西医结合、护理等)方面的最新成果,并兼顾老年社会学(人口老化、健康老龄化、老年教育、养老及社区服务、老年保健等)、老年心理学、衰老生物学及抗衰老研究等方面的文章。辟有述评、基础研究、临床研究、理论探讨、调查研究、经验交流、病例报告、康复护理、综述及学术动态等栏目。被中国自然科学核心期刊研究课题组列为中国自然科学核心期刊、北大图书馆・北京高校图书馆期刊工作研究会列为中文核心期刊,并被中国科学引文数据库、中国生物学文献数据库、中国期刊全文数据库、中国学术期刊综合评价数据库、中文科技期刊数据库、中国核心期刊(遴选)数据库、解放军医学图书馆数据库及中国数字图书馆示范工程超星数字图书馆收录及列为统计源期刊。并被《中国医学文摘・老年学分册》、《中国生物学文摘》、《中文科技资料目录(医药卫生)和(中草药)》等检索性期刊摘录。并被评为第二届北方优秀期刊。面向老年学及相关学科的科研、教学和医疗的科研人员、医务工作者及广大师生。本刊为半月刊,国际大16开,每月10日及25日出版,定价9100元,全年定价216100元,邮发代号12274,全国邮局均可订阅。同时以印刷版、光盘版及网络版发行,信息容量大且报道时效性强。并竭诚欢迎医药、医疗器械等相关厂家刊登广告。订阅可直接汇款至《中国老年学杂志》编辑部,请注明所购卷期及册数。地址:长春市建政路971号　《中国老年学杂志》编辑部邮编:130061　电话(传真):4;5　Email:okgood911@1261com