2024年3月16日发(作者：华为matebookd14笔记本)

黄芪多糖对HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响

王旗;吴成声;李辉;许业传

【摘 要】目的:研究黄芪多糖对人结直肠癌HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响,

并初步探讨其作用机制.方法:体外培养人结直肠癌HCT116细胞,分别以0.0、0.1、

0.2,0.4、0.6、0.8和1.0 g/L的黄芪多糖干预HCT116细胞24 h,采用MTT法检

测HCT116细胞的存活情况.采用0.0、0.1和0.6 g/L黄芪多糖作用HCT116细胞

24 h后,Transwell和划痕实验检测侵袭和迁移能力,采用Western blot检测细胞

中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达水平.结果:黄芪多糖能够剂量依赖

性抑制HCT116细胞增殖.0.6 g/L黄芪多糖处理HCT116细胞24 h后,细胞侵袭

和迁移能力,MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均显著下降(P<0.05).结论:黄芪多

糖能够抑制HCT116细胞侵袭和迁移,其作用机制可能与下调MMP-2、MMP-9

的表达有关.

【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2018(053)006

【总页数】5页(P820-824)

【关键词】黄芪多糖;结直肠癌细胞;基质金属蛋白酶;侵袭;迁移

【作 者】王旗;吴成声;李辉;许业传

【作者单位】铜陵市立医院普外二科 安徽铜陵244000;铜陵市立医院普外二科 安

徽铜陵244000;铜陵市立医院普外二科 安徽铜陵244000;安徽医科大学第一附属

医院普外科 合肥230022

【正文语种】中 文

【中图分类】R735.3

结直肠癌是一种发生于消化道系统的常见恶性肿瘤，近年来其发病率和病死率呈上

升趋势，严重危害人们的健康和生命[1]。肿瘤侵袭和转移与结直肠癌患者的生存

和预后密切相关[2]。黄芪多糖是从豆科植物黄芪干燥根茎中提取的主要活性成分，

具有抗病毒、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化等多种药理学作用[3]。它可抑制

宫颈癌细胞增殖和侵袭[4]；能够抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡[5]；可逆转

食管癌细胞顺铂耐药性[6]；能够抑制视网膜瘤细胞侵袭[7]。最近有研究[8]显示，

黄芪多糖可抑制人结直肠癌细胞增殖，并通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。本研

究用黄芪多糖干预体外培养的人结直肠癌HCT116细胞，检测细胞侵袭和迁移能

力以及相关蛋白水平的变化，探讨黄芪多糖影响结直肠癌细胞侵袭和迁移的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂来源 黄芪多糖标准品购于北京索莱宝科技有限公司，纯度大于90%；人

结直肠癌细胞株HCT116购于美国ATCC细胞库；DMEM培养基购于美国Gibco

公司；胎牛血清、胰蛋白酶购于美国HyClone公司； MTT、二甲基亚砜(DMSO)

购于美国Sigma公司；Transwell小室、Matrigel胶购于美国Corning公司；基

质金属蛋白酶(matrix metallo protease，MMP)-2抗体、MMP-9抗体、β-

actin抗体及辣根酶标记的二抗均购于美国Santa Cruz公司；BCA蛋白定量试剂

盒购于碧云天生物技术有限公司；ECL发光检测试剂盒购于大连宝生物工程有限公

司。

1.2 细胞培养 HCT116细胞复苏后置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养

基的培养瓶中，于37 ℃、体积分数5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养，当细胞

生长至约90%汇合度时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，以血清终止消化，吹打离心

后，用新鲜完全培养液重悬细胞进行传代，取传2～3代后的细胞用于后续实验。

1.3 MTT法检测HCT116细胞存活率 将处于对数生长期的HCT116细胞接种于

96孔板中，每孔约5×103个细胞，置于37 ℃培养箱培养。待细胞单层贴壁后，

分别用含终浓度为0.0(对照)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L黄芪多糖的

DMEM细胞培养液处理，每个浓度设置3个复孔。继续培养24 h后，加入MTT

溶液20 μL孵育4 h，弃上清液，加入DMSO 100 μL，置摇床上避光混匀，待沉

淀完全溶解后，用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度(A)值，计算细胞存活率。

细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4 划痕实验检测HCT116细胞迁移能力 在超净工作台中用封口膜将6孔板封好，

在板背面用Marker笔沿其直径划平行等距线，备用。收集对数期生长的HCT116

细胞，接种于划线的6孔板中，接种密度为4×105个/孔，置于体积分数为

5%CO2的37 ℃培养箱中培养至汇合度为80%时，进行划痕实验。用移液枪枪头

在垂直于预先划线的方向进行划痕，保证枪头与板垂直，使得划痕宽度保持一致。

划痕结束后加适量PBS洗去细胞碎片，分别加入终浓度为0.0、0.1、0.6 g/L的黄

芪多糖，每个浓度设置3个复孔，继续培养24 h后，测量细胞迁移距离。迁移抑

制率=(对照组迁移距离-实验组迁移距离)/对照组迁移距离×100%。

1.5 Transwell实验检测HCT116细胞侵袭能力 胰蛋白酶消化后用不含血清的培

养基重悬HCT116细胞，制备单细胞悬液，将细胞浓度调整为4×105个/mL。将

细胞悬液加入到上室中，再加入终浓度为0.0(对照)、0.1、0.6 g/L的黄芪多糖，

每个浓度设置3个复孔。下室加入600 μL含血清的DMEM培养基。将

Transwell小室置于37 ℃培养箱中孵育24 h取出，用镊子轻轻取下滤膜，以50

g/L戊二醛4 ℃固定10 min，1 g/L结晶紫染色30 min，PBS漂洗后拭去未穿过

的细胞及碎片。随机选取5个视野，计数穿膜细胞数。侵袭抑制率=(对照组侵袭

细胞数-实验组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100%。

1.6 Western blot检测HCT116细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表达 将对数生

长期的HCT116细胞接种于培养皿中，于37 ℃培养箱中培养24 h，换液后加入

终浓度为0.0、0.1、0.6 g/L的黄芪多糖继续培养24 h，收集细胞。分别加入裂解

液置冰上裂解10 min，以12 000 r/min离心10 min，提取细胞总蛋白。以BCA

蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，将蛋白与上样缓冲液按体积比4∶1进行混合，

置于沸水中加热变性，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。采用半干法转膜至

PVDF膜上，在含50 g/L的脱脂奶粉封闭液中封闭4 h。分别加入MMP-2一抗

(1∶1 000倍稀释)、MMP-9一抗(1∶800倍稀释)，4 ℃摇床上孵育过夜，TBS洗

涤3次，加入二抗(1∶1 500倍稀释)，室温孵育2 h。TBS洗涤3次，以ECL试

剂盒进行发光，于暗室中经凝胶成像系统扫描，采用Image J图像分析系统分析

条带灰度值，以MMP-2、MMP-9条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示

MMP-2、MMP-9蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS 21.0进行分析，以单因素方差分析和两独立样本t检

验比较各组HCT116细胞存活率、迁移和侵袭能力、MMP-2和MMP-9蛋白表

达水平，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 黄芪多糖对HCT116细胞存活率的影响 结果见表1。当黄芪多糖浓度为0.8

和1.0 g/L时，HCT116细胞存活率低于70%。故选择0.1、0.6 g/L的黄芪多糖

用于后续实验。

表1 不同浓度的黄芪多糖对HCT116细胞存活率的影响ρ(黄芪多糖)/(g/L)n 存活

率

/%0.1393.24±2.690.2389.35±2.180.4383.24±1.760.6375.57±1.580.8364.49±

1.151.0351.89±1.04

F=301.705，P<0.001；组间两两比较，P<0.05

2.2 黄芪多糖对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响 结果见表2、3，黄芪多糖能

够抑制HCT116细胞的迁移和侵袭，抑制作用随浓度的升高而增强。

表2 3组HCT116细胞迁移能力的比较ρ(黄芪多糖)/(g/L)n迁移距离/μm迁移抑

制率/%0.03197.26±31.17-

0.13130.02±27.52*22.34±4.270.63112.31±25.38*#43.15±5.12F/t28.087

94.293P0.001 <0.001

*：与0.0 g/L黄芪多糖组比较， P<0.05；#：与0.1 g/L黄芪多糖组比较，

P<0.05

表3 3组HCT116细胞侵袭能力的比较ρ(黄芪多糖)/(g/L)n侵袭细胞数侵袭抑制

率/%0.031 189.34±48.26 -0.13981.25±38.42*

17.49±2.440.63639.48±24.54*# 46.26±5.26F/t157.392 146.051 P<0.001

<0.001

*：与0 g/L组比较， P<0.05；#：与0.1 g/L黄芪多糖组比较，P<0.05

2.3 黄芪多糖对HCT116细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的影响 结果见

图1和表4，黄芪多糖剂量依赖性地抑制HCT116细胞中MMP-2和MMP-9蛋

白的表达。

1、2、3：分别为0.0、0.1和0.6 g/L黄芪多糖组图1 3组HCT116细胞中

MMP-2和MMP-9蛋白的表达表4 3组HCT116细胞中MMP-2和MMP-9蛋

白表达的比较

ρ(黄芪多糖)/(g/L)nMMP-2MMP-

90.030.54±0.060.92±0.110.130.33±0.04*0.52±0.06*0.630.14±0.02*#0.27±0.

03*#F64.33958.283P<0.001<0.001

*：与0.0 g/L黄芪多糖组比较，P<0.05；#：与0.1 g/L黄芪多糖组比较，

P<0.05

3 讨论

结直肠癌是临床上常见的胃肠道恶性肿瘤之一，受饮食、遗传、环境等因素的影响，

其发病率逐年上升[9]。寻找高效低毒的抗癌药物是肿瘤治疗的热点及难点[10-12]。

黄芪多糖是黄芪的主要活性成分。相关研究[13-15]显示，黄芪多糖能够通过多种

途径抑制肿瘤细胞增殖，诱发细胞凋亡，阻滞肿瘤细胞周期的进程，抑制肿瘤细胞

的侵袭和迁移。作者通过MTT实验发现黄芪多糖可抑制结直肠癌细胞增殖。本实

验选取0.1和0.6 g/L的黄芪多糖干预HCT116细胞，探究黄芪多糖对结直肠癌细

胞侵袭和迁移能力的影响及其作用机制。

本研究发现黄芪多糖可抑制HCT116细胞的迁移和侵袭。这与Wu等[17]的研究

相似，他们发现黄芪多糖通过抑制NF-κB活性，抑制人肺癌细胞A549的转移，

发挥抗肿瘤活性。黄芪多糖还通过抑制AKT信号通路抑制胃癌AGS细胞的侵袭和

转移[18]。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家族中主要成员，主要功能是降

解和重塑细胞外基质[19]。目前研究[20]证实MMP-2和MMP-9活性或表达水平

升高时，乳腺癌细胞表现出较高的侵袭性和转移性。结直肠癌的恶性生物学表型及

预后与MMP-2和MMP-9的表达紧密相关，且结直肠癌细胞的侵袭和转移与

MMP-2和MMP-9有关[21]。本实验结果显示，黄芪多糖能够显著下调结直肠癌

细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平。

总之，黄芪多糖能够显著抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移，其作用机制与下调

MMP-2和MMP-9的表达有关。

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