2024年4月11日发(作者：)

外泌体分离提纯草案

By 朱旭峰

一、 以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）

1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。（sigma）

1.1 细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比

1.2 快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地

细胞和残渣。超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor

A-641) 4 ℃ . 2 小时

1.3 用1mL 冷的 PBS 重悬和清洗 小囊泡 ，再次超速离心 120,000_g

(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃ . 2 小时

1.4 再用100μL 冷的 PBS 重悬后转移到 低粘附的管中

1.5 快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL

的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)

2 材料

a)

b)

c)

d)

e)

f)

二、

细胞培养液

蛋白酶抑制（Sigma）

过滤筛(Millipore)

冷的 PBS

低粘附的管

Direct Detect™(Millipore)

以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）

(Sigma)

1.2 将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟 4℃

1.3 小心地再将上清液移至新的管中 离心 10000*g 30分钟于4℃ 来

去除较大的囊泡、

1.4 此阶段的样品可以

1.5 将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g

(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时 4℃

1.6 用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，

1.7 将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬

1.8 外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏

2. 材料

1.1 在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂

a) 蛋白酶抑制（Sigma）

b) 过滤筛(Millipore)

c) 冷的 PBS

d) 低粘附的管

e) Direct Detect™(Millipore)

三、 ExoQuick

TM

化学沉淀法

1.1 ExoQuick

TM

的使用要按照厂家提供的说明书来实行

1.2 该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用

倒相管

按照所指示的量来加入ExoQuick

TM

试剂盒里的溶液

1.3 溶液孵化过夜，在4℃ 温和的摇晃

1.4 在流式细胞仪缓冲液中洗涤

1.5 试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可

(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。

2 材料

a) ExoQuick

TM

试剂盒

b) 流式细胞仪

四、 用ME

TM

分离外泌体

NEP)稀释

1.2 样品要事先处理好，17,000g 7分钟 来去除微粒物质

1.3 然后用ME

TM

试剂来孵化样品(NEP peptide)并且用旋转震荡在室温

混合15分钟

1.4 孵化完的样品要室温离心10000g 7分钟

1.5 所有的样品要用PBS洗三次

1.6 最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬

五、 抗体

以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：Westen Blot，ELISA和FACS（流

式细胞术）

1.1 mAb aCD9, mAb aCD63, mAb aCD81, mAb aCD63-FITC, aCD81-PE, 来

自于 Beckton Dickinson,

1.2 mAb aCD63-biotin (BioLegend),

1.3 mAb aAlix (Santa Cruz),

1.4 mAb aTsg101 (Abcam),

1.5 pAb aRab5 (Santa Cruz),

1.6 mrAb aRab5 (Epitomics),

1.1 样品（CM或人血清）要按照商品说明书(New England Peptide –

1.7 mAb aCalnexin (Abcam),

1.8 二抗是 anti-Mouse和 anti-Rabbit HRP-conjugated (Dako). 专门的

肿瘤外泌体 (HBM1 and HBM2) 结合抗体 由 HansaBioMed R&D

team.提供

六、 用Westen Blot 探测外泌体的蛋白

下

1.2 用SDS-page分离外泌体的蛋白质

1.3 把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GE Healthcare）

1.4 一二抗体孵化

1.5 信号要在暗室里用ECL附加

七、 外泌体免疫捕捉和蛋白定量 ELISA

免疫捕捉 而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲

液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）

1.2 PBS加入0.05% Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示

说明，应该用PBS稀释样品

1.3 将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100

μl），孵化4℃过夜或者 室温2小时（可以使用商业化的exosomes

捕捉平板(HansaBioMed)）

1.4 传统上的protocol包含使用主要的抗体（aCD9或aCD63）在样品缓

冲液（0.5%BSA PBS）中稀释2小时于4℃。

1.5 在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶二抗（BioRad），在需要的地方

用样品缓冲液1小时于4℃。

基于BM Blue POD Substrate辣根过氧化物酶的底物 (Roche)反应的

光密度反应，在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000 (TECAN)

a) QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Scientific)要用连

续的激发 光束在325/425nm

b) SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo

Scientific)要先孵 化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数

2. 材料

a) 96孔板

b) 碳酸氢盐缓冲液PH=9.6

c) BSA PBS Tween-20 蔗糖

d) 辣根过氧化物酶二抗

1.1 从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆 为

1.1 将样品用合适容积的蛋白loading Buffer（Lonza）重悬在合适的浓度

e) 辣根过氧化物酶的底物

f) 酶标仪

八、 磁珠捕获外泌体

1. 商业化的预包裹的乳胶微球

1.1 根据商品说明书(HansaBioMed)来分离外泌体

1.2 每个样品先用1ml的PBS来稀释

1.3 选用合适的珠子去孵化4℃过夜，旋转震荡。

1.4 之后可以用离心的方法来分离（5000个，10分钟），再用PBST洗涤3

次。

2. 磁珠分离法

2.1 比较了“1μm大小的链霉亲和素磁珠” (Thermo Scientific, 88816)

和“亚显微大小的超磁力珠”（内部订购）

2.2 先用PBST洗涤磁珠然后加入1.2μg的抗体（外泌体结合的同种抗体，

CD9抗体（Beckton Dickinson））

2.3 生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠，然后用PBST洗三次，再用合

适的固定剂固定（干酪素，BSA或人血清）室温1小时

2.4 重悬于PBS，然后加入样品（CM或人血浆）

2.5 为了最终可以富集磁珠到近10

8

/ml，将其孵化过夜4摄氏度旋转

rotation

2.6 用电磁分离磁珠，在量化外泌体蛋白或提取外泌体RNA之前用PBST

洗三次

2.7 磁珠也会溶解于Laemmli buffer，所以在做为westen bolt先将其煮沸

或者可以选择做bead-based ELISA

3. 免疫珠分离法

3.1 用主要的抗体孵化免疫磁珠2小时于室温，用ELISA缓冲液冲洗

3.2 再加入二抗(辣根过氧化物酶)孵化1小时，然后大量的冲洗之

3.3 为了可以被侦测到，需加入底物BM Blue POD Substrate (Roche)，孵

化10分钟为了终止反应，加入硫酸，并在450nm波长下读数

4. 材料

a) 商品化的磁珠

b) 辣根过氧化物酶二抗

c) 辣根过氧化物酶的底物

d) 酶标仪

e) PBST