2024年4月11日发(作者：)

山东医药２０１０年第５Ｏ卷第ｌ８期　

・

基础研究・　

ＭＭＰ．２靶向ＲＮＡｉ质粒的构建及其对小鼠　

巨噬细胞ＭＭＰ一２表达的沉默作用　

王政。李为民，周宏艳，郭虹凤，孙文学　

（哈尔滨医科大学第一临床医学院，哈尔滨１５０００１）　

摘要：目的构建基质金属蛋白酶２（ＭＭＰ－２）靶向的ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）质粒，观察其对小鼠巨噬细胞ＭＭＰ－２　

设计能转录小发卡结构ＲＮＡ的ＤＮＡ序列，并与ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ质粒载体连接，构建受　基因表达的沉默作用。方法

控于人ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子ｕ６的真核表达质粒ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ．ＭＭＰ－２；将此质粒导入小鼠巨噬细胞内，采用ＲＴ—　

ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ和免疫荧光技术检测小鼠巨噬细胞中的ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ及蛋白表达。结果　重组质粒ｐｓｉ　

ＳＴＲＩＫＥ　．ＭＭＰ－２用限制性Ｐｓｔ　Ｉ内切酶酶切后，琼脂糖凝胶电泳中可清楚地看到重组载体被切为２个片断，证明　

重组质粒构建成功。将其转染小鼠巨噬细胞后，ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ及蛋白表达下调。结论成功构建了ＭＭＰ－２靶向　

ＲＮＡｉ质粒，其能明显抑制小鼠巨噬细胞ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ及蛋白的表达。　

关键词：基质金属蛋白酶；ＲＮＡ干扰；肺纤维化　

中图分类号：Ｒ６５５．３　文献标志码：Ｂ　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１０）１８４）０２５．０２　

ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）是一种进化上保守的抵御转　

基因或外来病毒侵犯的防御机制，是指内源性或外　

源性与靶基因的转录产物ｍＲＮＡ存在同源互补序　

列的双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），在细胞内特异地降解该　

ｍＲＮＡ，是一种序列特异性的转录后基因沉默　

（ＰＴＧＳ）…。ＲＮＡｉ具有快速、有效、容易操作和序列　

中选取小鼠ＭＭＰ－２基因序列，采用ｓｉＲＮＡ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｄｅ—　

ｓｉｇｎｅｒ—Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．５１设计软件设计２对ＭＭＰ－２基因发　

卡寡核苷酸，序列符合ｓｉＲＮＡ表达载体ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ　

Ｕ６的要求。ＤＮＡ序列片断由上海生工公司合成。　

１．２．２　ＭＭＰ－２　ｓｉＲＮＡ表达载体的构建　ｌ　

人工合成单链核苷酸在退火缓冲液中，９０℃３　ｍｉｎ　

特异性强等优点　Ｊ。肺问质纤维化是一种进行性　

加重的弥漫性肺疾病，可造成肺结构与功能不可逆　

损伤【３】。近年发现，基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）在肺　

纤维化的发生发展中起重要作用　Ｊ。２００９年９—１　１　

月，我们设计了能转录小发卡结构ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）的　

后缓慢降到室温。与５　快速连接缓冲液、１　

ｐｓｉＳＴＲＩＫＥ　。Ｍ载体（５０　ｎｇ／　１）、２　ｌ　Ｎｕｅｌｅａｓｅ—Ｆｒｅｅ水　

和１　Ｔ４　ＤＮＡ连接酶（３　ｕ／　）配制成连接反应　

液，室温培养ｌ　ｈ。加人１００　ｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９感受态　

细胞中，冰浴。加入４００　ｗｌ室温的ＬＢ培养液，３７　

℃振荡培养（５０　ｒ／ｍｉｎ）４５　ｍｉｎ。２００　转化液涂在　

ＤＮＡ序列，并与ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ质粒载体连接，构建受　

控于人ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子ｕ６的真核表达载体，　

以脂质体法将重组质粒导人小鼠巨噬细胞内，观察　

该质粒对小鼠巨噬细胞ＭＭＰ－２表达的影响。　

１材料与方法　

１．１材料ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ　Ｕ６载体，小鼠巨噬细胞系　

ＲＡＷ２６４．７，限制性内切酶Ｐｓｔ　Ｉ，质粒小量提取试剂　

ＬＢ／氨苄西林平板上铺板，３７℃过夜培养。挑取菌　

落，小量提取质粒，经ｐｓｔ　Ｉ酶切鉴定正确的重组质　

粒命名为ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ－ＭＭＰ－２，一２０℃保存。　

Ｉ．２．３　ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ．ＭＭＰ－２基因转染　将　

ＲＡＷ２６４．７细胞接种于６孔板，置于３７　ｏＣ、５％ＣＯ：　

盒，凝胶回收试剂盒，Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｎｅ　２０００转染试剂，　

总ＲＮＡ提取试剂盒，ｃＤＮＡ反转录试剂盒，ＲＰＭＩ一　

１６４０培养基，山羊抗鼠ＭＭＰ－２抗体，Ｆ１ＴＣ一兔抗山羊　

ＩｇＧ。　

培养箱中，待细胞生长融合达９０％时，采用Ｌｉｐｏｆｅｅｔ—　

ａｌｌｌｌｌｅＴＭ　２０００转染试剂进行转染。实验分为实验组、　

阴性对照组和空白对照组。实验组每孔分别加入４　

脂质体和ｐｓｉＳＴＲＩＫＥ￣／ＭＭＰ－２重组质粒２　ｇ，阴　

性对照组加ＬｉｐｏｆｅｅｔａｍｎｅＴＭ　２０００转染试剂和ｓｉＳ—　

ＴＲＩＫＥＴＭＵ６质粒２　ｇ，空白对照组则不加任何干扰　

因素。分别于转染前、转染后２４、４８、７２　ｈ收获细胞　

检测ＭＭＰ－２的表达水平。　

１．２．４　ＲＡＷ２６４．７细胞ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ检测方法　

２５　

１．２方法　

１．２．１　ＭＭＰ－２特异性ｓｉＲＮＡ的设计从ＧｅｎＢａｎｋ　

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目（１１５３１１３０）。　

山东医药２０１０年第５０卷第ｌ８期　

采用ＲＴ．ＰＣＲ法。应用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取细胞总　

ＲＮＡ，用逆转录试剂盒进行逆转录合成ｃＤＮＡ。以　

Ｂ．ａｃｔｉｎ为内对照，ＲＴ．ＰＣＲ扩增ＭＭＰ－２目的基因。　

产物经含０．５　ｍｇ／Ｌ溴化乙啶的１．５％琼脂糖凝胶　

的特点。ＭＭＰｓ与细胞因子、生长因子之间以一个　

十分复杂的网络联系，参与肺问质纤维化的发生发　

展。肺泡巨噬细胞分泌ＭＭＰｓ，主要包括ＭＭＰ－２、　

ＭＭＰ－９等。它们都以酶原的形式被分泌，通过一系　

电泳分析结果，重复３次。凝胶扫描系统分析处理，　

以ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ与Ｂ—ａｃｔｉｎ　ｍＲＮＡ的灰度比值作为　

ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ的表达量。　

１．２．５　ＲＡＷ２６４．７细胞ＭＭＰ－２蛋白检测方法采　

用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法，按试剂盒说明书操作，重复３次，　

以凝胶扫描系统Ｌａｂｗｏｒｋｓ软件计算灰度值。　

１．２．６统计学方法采用ＳＰＳＳ１３．０软件分析。组　

内比较和组间比较用方差分析及ｔ检验。Ｐ≤０．０５　

为差异有统计学意义。　

２结果　

２．１　ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ－ＭＭＰ－２重组质粒的鉴定结果　

ｐｓｉＳＴＲＩＫＥ　Ｍ。载体包含一个Ｐｓｔ　Ｉ位点，重组质粒将　

会形成第２个Ｐｓｔ　Ｉ位点。经限制性Ｐｓｔ　Ｉ内切酶消　

化后，成功的重组质粒将产生２个ＤＮＡ片断。重组　

质粒ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ＿ＭＭＰ＿２用限制性Ｐｓｔ　Ｉ内切酶酶　

切后，琼脂糖凝胶电泳中可清楚地看到重组载体被　

切为２个片断，证明重组质粒构建成功。　

２．２各组细胞ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ表达比较阴性对照　

组ＭＭＰ一２　ｍＲＮＡ表达量为１．３２６±０．０５２，空白对照　

组为１．２５７士０．０６７，实验组转染２４、４８、７２　ｈ时分别　

为０．７１３±０．０７５、０．３３４±０．０５９、０．１９２－Ｉ－０．０４１，与　

阴性对照组、空白对照组比较，Ｐ均＜０．０１。　

２．３各组细胞ＭＭＰ－２蛋白表达比较阴性对照组　

ＭＭＰ．２蛋白表达量为１８５．９０土２２．７２，空白对照组　

为１８２．９０±２２．７２，实验组转染２４、４８、７２　ｈ时分别　

为１４２．６６±１８．２４、５３．０４±９．８６、３９．４１±５．６３，与阴　

性对照组、空白对照组比较，Ｐ均＜０．０１。　

３讨论　

肺纤维化是多种原因引起的以成纤维细胞增殖　

及大量细胞外基质（ＥＣＭ）聚集为特征的疾病。其　

病理特点是长期慢性肺部炎症及肺泡持续性损伤，　

反复破坏、修复、重构和胶原过度沉积，肺实质广泛　

重塑。肺纤维化的发生是一个复杂的过程，过去认　

为肺纤维化都是肺部炎症损伤的结局。现研究发　

现，其发病机制涉及多种生长因子，包括ＭＭＰｓ、转　

化生长因子．Ｂ、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因　

子、成纤维生长因子、血管内皮生长因子等。其中，　

ＭＭＰｓ尤其是ＭＭＰ．２起关键作用　Ｊ。ＭＭＰｓ是一类　

对细胞外基质具有降解活性的蛋白酶超家族。其在　

中性ｐＨ条件下，依赖ｃａ　和ｚｎ“为辅助因子而激　

活，可以降解所有ＥＣＭ成分。近年发现，肺泡上皮　

细胞破坏与基底膜损伤是肺问质性纤维化病变早期　

２６　

列的酶切作用被激活，都可以降解Ⅳ型胶原。其中，　

ＭＭＰ－２与细胞因子、生长因子之间的相互激活，通　

过对ＥＣＭ的降解，链接了炎症细胞与肺结构细胞　

之间的信息交流，介导了肺泡炎症与进行性肺问质　

纤维化的进程　，’】。ＲＮＡｉ是用由ｄｓＲＮＡ前体剪切　

产生的短的反义ＲＮＡ靶定对应的ｍＲＮＡ，然后进行　

剪切，促使ｍＲＮＡ降解。ＲＮＡｉ可以高效、特异的阻　

断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因　

缺失的表型，是基因沉默的理想工具，可直接抑制疾　

病相关基因，从而达到治疗或预防疾病的目的口　】。　

本研究成功克隆了靶向小鼠巨噬细胞ＭＭＰ－２的　

重组质粒。体外实验表明，ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ—ＭＭＰ－２重组　

质粒能明显下调小鼠巨噬细胞ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ和蛋白　

的表达，且ＭＭＰ－２　ｍＲＮＡ和蛋白表达的抑制率相对　

一

致，说明ＭＭＰ－２表达的抑制位点在蛋白质翻译过　

程之前，这也符合ＲＮＡｉ转录后基因沉默的作用机　

制。本研究结果说明，ｐｓｉＳＴＲＩＫＥＴＭ—ＭＭＰ－２　ＲＮＡ干扰　

质粒能够特异、高效地抑制巨噬细胞ＭＭＰ－２的表达，　

提示通过ＲＮＡｉ降低巨噬细胞中ＭＭＰ－２表达，可能减　

少肺脏细胞外基质的降解，从而防止肺纤维化的进　

展。但肺纤维化是一个长期而又复杂的过程，其中有　

很多机制我们尚未完全了解，还需要进一步研究。　

参考文献：　

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ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｓｉｎｇ　ｏｆ　ｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｉＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｃｏｈｎｏｌ，　

２００８，２６（５）：５７８－５８３．　

（收稿１３期：２０１０－０３－０２）