2024年3月5日发(作者：)

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烟粉虱抗、感杀虫剂品系内生菌群落的差异分析

作者：陈露谷少华王雄雅李显春

来源：《植物保护》2018年第01期

摘要

本研究对B型和Q型烟粉虱的吡虫啉或吡丙醚的抗、感品系进行16S rRNA细菌多样性测序分析，以明确内共生菌的种类和数量与烟粉虱生物型和抗性的关系。结果表明Candidatus

Nitrososphaera、Bacillus、Sphingobium只在Q型烟粉虱中存在，而Candidatus Hamiltonella、Lactobacillus、Helicobacter等只在B型烟粉虱中存在，说明这些内共生菌可能与烟粉虱B、Q两种生物型的分化有关；内共生菌Rickettsia、Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella、S247、Prevotella等在烟粉虱的新烟碱类杀虫剂吡虫啉抗性品系中明显多于敏感品系，其可能与烟粉虱对吡虫啉的抗性有关；在对保幼激素类似物杀虫剂吡丙醚的抗性品系中，Candidatus

HamiltonellaOTU7、Candidatus PortieraOTU5、Candidatus PortieraOTU190、RickettsiaOTU4、RickettsiaOTU2的数量明显多于敏感品系，说明这些内共生菌可能与烟粉虱对该类药物的抗性有关。

关键词

烟粉虱； 生物型； 抗药性； 16S rRNA测序； 内共生菌

中图分类号：

Q 965

文献标识码： A

DOI： 10.16688/.2017141

Comparative analysis of bacterial community between insecticide

resistant and susceptible strains of Bemisia tabaci

CHEN Lu1， GU Shaohua1， WANG Xiongya1， LI Xianchun1，2

（ Key Laboratory for Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural

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Sciences， Beijing 100193， China； 2. Department of Entomology， University of Arizona，

Tuson 85721， USA）

Abstract

To study the relationships between biotypes and resistance of Bemisia tabaci and its

endosymbionts，we compared the microbiota among different strains of B and Q biotypes that are

susceptible or resistant to neonicotinoids orpypriproxyfen by using 16S rRNA amplicon sequencing

atus Nitrososphaera， Bacillus and Sphingobsium were found in Q biotype strain

only， whereas Candidatus Hamiltonella， Lactobacillus and Helicobacter were detected only in the

B biotype suggested that these endosymbionts might be related to the differentiation of

B/Q tsia， Candidatus Portiera， Candidatus Hamiltonella， S247 and Prevotella

were significantly enriched in the imidacloprid resistant strains than in the susceptible strain，

suggesting that these endosymbionts might contribute to ’s resistance to

rmore， the pyriproxyfenresistant strain carried significantly more Candidatus

HamiltonellaOTU7， Candidatus PortieraOTU5， Candidatus PortieraOTU190， RickettsiaOTU4

and RickettsiaOTU2 than the susceptible strain， implicating that these endosymbionts might be

involved in ’s resistance to pyriproxyfen. Taken together， the data obtained support the

involvements of endosymbionts in B/Q differentiation and their resistance to insecticides.

Key words

Bemisia tabaci； biotype； insecticide resistance； 16S rRNA amplicon sequencing；

endosymbiont

共生菌与节肢动物共生是一种广泛存在的现象，近年来逐渐成为昆虫学的研究热点之一[1]。在长期的进化过程中，昆虫趋向于与一些微生物建立内共生关系，这一现象在鞘翅目和半翅目昆虫如蝉、蚜虫、褐飞虱、烟粉虱中尤为突出[2]。昆虫内共生菌通常分为两大类：初生内共生菌和次生内共生菌[34]。昆虫与内共生菌的互作关系多种多样：一些初生内共生菌能够通过自身的代谢活动弥补宿主由于食物源限制而导致的某些必需氨基酸和维生素的缺乏；也可通过分泌毒素、抗生素等物质来降低或防止病原体或外源有害寄生物感染宿主；同时，还能够增强宿主环境适应性，改变宿主入侵性，调控植物生理反应，抑制植物对宿主的不利影响；利用对抗逆性基因精确的表达调控来增强宿主抗药性等[1]。值得一提的是，即使是同一种共生菌，在不同的宿主体内所发挥的作用也不尽相同[1]。随着研究的深入，内生菌的新功能不断地被发现，如研究较为成熟的Rickettsia，当与蚜虫共生时能够提高蚜虫的耐热力、改变蚜虫体色、增强蚜虫对瓢虫的抵抗力、降低其对寄生蜂的抗性，而当其存在于烟粉虱体内时则能够提高烟粉虱的产卵量及后代存活率、增强对宿主的适合度[58]。

20世纪90年代，人们逐渐认识到烟粉虱内共生菌具有重要的经济意义，对由其介导的昆虫适应性性状的研究越来越多[9]，但其作用机制尚不明确[1012]。内共生菌的水平传播方式加速了不同种群间内共生菌的交流，致使宿主由于获得环境中新的微生物而产生新的基因型和生

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物适应性状，包括耐热性、抗寄生、抗药性以及入侵能力[1]。有研究表明，烟粉虱B、Q生物型与其次生内共生菌之间存在一定的关联[1314]。不同的烟粉虱生物型mtDNA基因序列不同，包含的内共生菌也有各自的特点[15]。Olivier等发现，采集于不同地区的不同烟粉虱生物型，其内共生菌群落具有特异性[13]。此外内共生菌与昆虫抗药性之间也存在一定关系，如Xu等通过16S rRNA技术证实肠道内共生菌参与了南部长蝽Blissus insularis对杀虫剂的抗药性[16]。有研究表明，随着体内内共生菌的减少，灰飞虱对杀虫剂的抗性逐渐降低[17]；蚜虫体内的共生菌与有机磷杀虫剂抗性的产生有关[18]。

目前，烟粉虱对大部分常规杀虫剂均产生了不同程度的抗药性[19]。对烟粉虱抗性机制的早期研究主要集中在杀虫剂靶标、解毒代谢酶以及药剂排泄基因上，近年来的研究表明内共生菌也可能与昆虫对杀虫剂的抗性有关[2021]，Ghanim和Kontsedalov通过试验发现，烟粉虱不同品系内共生菌差异可显著影响其对杀虫剂的抗性[22]；Xie等通过转录组分析从分子水平揭示了烟粉虱内共生菌与其抗药性之间的关系[23]。目前，关于内共生菌与昆虫抗药性产生机制的关系主要有两种说法：（1）昆虫通过与能够降解农药的微生物共生而获得抗药性；（2）昆虫肠道的微生物通过改变菌落结构来激活宿主的免疫系统，使宿主的抗药性增强[2425]。

目前对烟粉虱内共生菌的研究大多局限在以下几个属，包括1个初生内共生菌Portiera

aleyrodidarum和6个次生内共生菌：Hamiltonella，Aresenphonus，Cardinium，Wolbachia，Rickettsia，Fritschea[26]，但较为全面系统地开展烟粉虱不同生物型或不同杀虫剂抗、感品系之间内共生菌种类和数量的研究仍为空白。因此，我们期望在前人研究的基础上，通过对烟粉虱抗、感杀虫剂品系内共生菌群落的差异比较，揭示烟粉虱内共生菌—生物型—抗药性之间的互作关系，这对烟粉虱田间防治、生态系统评估等都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

烟粉虱敏感品系（susceptible strain，S）：美国亚利桑那大学昆虫学实验室提供，经过在室内不接触任何农药的条件下采用烟草（‘亚布力旱烟’）连续多代饲养繁育而成。烟粉虱抗性品系（resistant strain，R）：美国亚利桑那大学昆虫学实验室提供，经过在室内以高浓度相应农药定期筛选以保持其抗性水平。试验时先对每个品系取5头烟粉虱成虫，采用CAPS标记法鉴定试验所用6个品系烟粉虱的生物型纯度[26]。各个品系及其代号对应关系见表1。

1.2 烟粉虱毒力测定

卵的毒力测定参照Denehy等[27]的着卵叶片浸渍法。在预试验的基础上，将吡丙醚用ddH2O配成系列浓度（含0.1%的吐温+曲拉通），0.1%吐温+曲拉通水溶液作为对照，每个浓度3个重复。将1片真叶期的棉苗放入事先开好透气孔的培养皿中，每皿接入20对自然混合日龄的烟粉虱成虫，放入培养箱中，温度（26±1）℃，湿度70%±10%，光周期L∥D=16 h∥8

h，产卵24 h之后将棉苗取出并浸入到不同浓度的药液中，20 s后取出晾干并固定在盛有清水

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的闪烁瓶内，再次放入培养箱中。7 d后记录孵化出的1龄若虫的数量，并计算孵化率，孵化率=若虫数/卵数×100%。

成虫的毒力测定参照Denehy等的内吸叶碟法。在预试验的基础上，将吡虫啉用ddH2O配成系列浓度（含0.1%的吐温），用0.1%吐温水溶液作为对照，每个浓度和对照各3个重复。每个浓度的烧杯内插入3株2 片真叶期的去根棉苗（‘京益1号’），棉苗于培养箱中内吸吡虫啉24 h之后，按浓度由低到高，依次摘下叶片，用打孔器打出直径为25 mm的叶碟待用。每个闪烁瓶内加入约5 mL 3%的琼脂，常温冷凝后，将叶碟背面朝上仔细贴在闪烁瓶底部的琼脂上。每个闪烁瓶内接入10对自然混合日龄的烟粉虱成虫，用透析膜封口，并倒置于温度（26±1）℃、湿度 70%±10%、光周期L∥D =16 h∥8 h的培养箱中，48 h之后观察，计算校正死亡率。

1.3 毒力测定数据分析

采用Probit软件，对毒力测定结果进行数据分析，计算各个品系的LC50、95%置信区间和抗性倍数（抗性倍数=抗性品系LC50/敏感品系 LC50）。抗性倍数在3以下定为敏感，3.1～5倍属于敏感性下降，5.1～10倍之间为低水平抗性，10.1～40倍为中等水平抗性，40.1～160倍为高水平抗性，160倍以上为极高水平抗性[28]。

1.4 烟粉虱内共生菌16S rRNA测序分析

每个品系选10头成虫，用95%乙醇清洗3次，单头提取总DNA，以该DNA为模板，按照V4区序列特征合成带有barcode的特异引物，引物信息如下：正向引物16SV4 F

5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA3′，反向引物16S V4 R 5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′。

PCR反应体系：50 μL的反应体系中含有10×Ex Taq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，16S

V4上、下游引物各1.0 μL，Ex Taq酶0.3 μL，稀释50倍后的DNA模板1.0 μL，加ddH2O补齐至50 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min，（95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s）×35个循环，72℃ 7 min，保持16℃。16S rRNA PCR产物的测序、序列拼接和注释均由北京赛默百合生物科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 烟粉虱各品系毒力测定结果

烟粉虱各品系毒力测定结果表明（表2），0852QR、1150WFPQR和Composite 11BR三个新烟碱类杀虫剂抗性品系成虫对吡虫啉的LC50显著高于新烟碱类杀虫剂敏感品系Yuma04BS的LC50，抗性倍数分别为144 500、133 800和15 600倍，均达到极高水平抗性。吡丙醚抗性品系QC02BR的卵对吡丙醚的LC50也显著高于其敏感品系1210GadsenBS的LC50，达到高水平抗性（表2）。

2.2 烟粉虱各品系内共生菌的16S多样性

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16S rRNA PCR产物的深度测序、序列拼接和注释结果表明，6个不同品系的

操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）总数目从141个（Yuma04BS）到206个（1150WFPQR）不等，且OTU总数在品系BS、BR、QR中呈现递增趋势；对每一品系来说，虽然2～19区间的OTU数量最多，但作用不大，因此仅选择大于50区间所包含的OTU进行后续的数据分析（表3）。

对每一品系所对应的所有OTU按照数目多少进行降序排列，取所有样品中排名前5 的OTU进行统计分析，发现6个品系共有且含量最多的内共生菌主要分布在Candidatus

Portiera、Candidatus Hamiltonella和Rickettsia这三个菌属（图1）。通过对6个品系的横向比较发现，初生共生菌Candidatus Portiera在6个品系中的含量均在45%以上，尤其是在品系QC02BR中可高达83.1%；Rickettsia在Q型烟粉虱中的含量明显高于B型烟粉虱；在Q型烟粉虱中并未检测到Candidatus Hamiltonella，而在4个B型烟粉虱中，3个品系都含有Candidatus Hamiltonella，仅在对吡丙醚的抗性品系QC02BR中未检测到Candidatus

Hamiltonella而检测到了Rickettsia，这可能是由于在抗性品系中Rickettsia将Candidatus

Hamiltonella竞争掉了的缘故。对每一品系所含有的OTU进行纵向比较可以看出，在品系Yuma04BS中，Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella和Rickettsia的OTU数分别占该品系总OTU数的65.1%、12.6%、0，三者共占该品系内共生菌总数的77%（图1）。在品系1210GadsenBS中，Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella和Rickettsia的比例分别为63.8%、5.2%、0，三者共占内共生菌总数的69%。在品系Composite 11BR中，Candidatus

Portiera、Candidatus Hamiltonella和Rickettsia的比例分别为62.3%、6.4%、0，三者共占内共生菌总数的68.7%。在品系QC02BR中，Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella和Rickettsia的比例分别为83.1%、0、4.3%，三者共占内共生菌总数的87.4%。在品系0852QR中，Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella、和Rickettsia的比例分别为47.4%、0、32.2%，三者共占内共生菌总数的79.6%。在品系1150WFPQR中，Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella和Rickettsia的比例分别为46%、0、37.6%，三者共占内共生菌总数的83.6%（图1）。

2.3 内共生菌对烟粉虱生物型的影响

Composite 11BR、0852QR、1150WFPQR均为对吡虫啉抗性品系，对Composite 11BR和0852QR这两个品系所包含的OTU 序列信息做对比分析，发现有30个数目在50以上的OTU仅存在于Q型品系0852QR，而在B型品系Composite 11BR中未检测到（表4）。这些OTU的属名为：Candidatus Nitrososphaera（总数668）、

节杆菌属Arthrobacter（489）、芽胞杆菌属Bacillus（262）、沃尔巴克氏属Wolbachia（154）、铜绿假单胞菌属Pseudomonas（113）、鞘氨醇单胞菌属Sphingobium（73）、红色杆菌属Rubrobacter（72）、詹森菌属Janthinobacterium（53）和鞘脂菌属Sphingobium（53）（表4）。

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对Composite 11BR和1150WFPQR这两个品系所包含的OTU 序列进行同样的对比分析，发现有10个OTU数目在50以上，而且仅存在于Q型品系1150WFPQR的OTU，划归在以下4个属：节杆菌属Arthrobacter（325）、Candidatus Nitrososphaera（281）、芽胞杆菌属Bacillus（189）和鞘脂菌属Sphingobium（50）（表5）。通过对表4、表5的综合分析，发现Candidatus Nitrososphaera、Bacillus和Sphingobium为2个Q型烟粉虱品系的共有菌属。

同样的OTU序列对比分析还发现，数目在50以上的OTU共有29个，且仅存在于B型品系Composite 11BR中，而在0852QR和1150WFPQR两个Q型品系中均未检测到（表6）。它们属于Candidatus Hamiltonella（10 320）、乳酸菌属Lactobacillus（576）、幽门螺杆菌属Helicobacter（531）、脱硫弧菌属Desulfovibrio（162）、Akkermansia（159）、Prevotella（117）、普雷沃菌属Prevotella（57）和Turicibacter（54）等菌属（表6）。

2.4 内共生菌对烟粉虱抗性的影响

比较在B型吡虫啉敏感品系Yuma04BS和抗性品系Composite 11BR检测到的OTU 序列，发现排在前六位的OTU在抗性品系的数目显著高于敏感品系，倍数差异由大到小分别为：RickettsiaOTU10（17.36倍）、Candidatus PortieraOTU85（15倍）、Candidatus

HamiltonellaOTU324（3.51倍）、S247OTU297（3.25倍）、PrevotellaOTU70（3.18倍）和Candidatus PortieraOTU190（3.0倍）（图2）。

3 讨论

本研究借助16S rRNA细菌多样性测序技术，在烟粉虱体内发现了更多种类的内共生菌，并对烟粉虱不同生物型或不同抗性品系的内共生菌进行了比较分析。由样品主要属分类水平物种组成柱形图可以看出（图1），各烟粉虱品系中数量最多的前3个内共生菌属占到了各品系内共生菌总量的68.7%～87.4%，其中，初生共生菌Candidatus Portiera在6个品系中含量均为最多，Rickettsia属在Q型烟粉虱中的含量高于B型，而Candidatus Hamiltonella仅能在B型烟粉虱中被检测到。这一结果表明，初生内共生菌Candidatus Portiera在烟粉虱体内是稳定存在的，这与其能够穿透宿主生殖细胞严格进行垂直传播有关[2930]。初生内共生菌一般通过合成必需的类胡萝卜素和必需氨基酸来弥补宿主食物源营养物质缺乏或不平衡，类似的内共生菌还有木虱体内的Carsonell以及蚜虫体内的Buchnera aphidicola等[3031]。由此可见，昆虫初生内共生菌对其生长发育是必不可少的。

Brown等发现，除了地理环境、繁殖力、抗性、入侵行为等因素之外，内共生菌的种类和数量也是烟粉虱生物型划分的一个重要依据，以上这些因素协同作用，直接或间接地影响烟粉虱生物型的分化[32]。本研究中，在对吡虫啉产生抗性的3个烟粉虱品系中，与B型烟粉虱Composite 11BR相比，内共生菌Candidatus Nitrososphaera、芽胞杆菌属Bacillus、鞘脂菌属Sphingobium等只在Q型烟粉虱0852QR和1150WFPQR这两个品系中存在（表4、表5），相反，内共生菌Candidatus Hamiltonella、乳酸菌属Lactobacillus、幽门螺杆菌属Helicobacter、脱硫弧菌属Desulfovibrio等只能在B型烟粉虱Composite 11BR中检出（表6），推测这些生

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物型特异的内共生菌可能在烟粉虱Q、B两种生物型分化过程中发挥了一定作用。已有很多研究证实，沃尔巴克氏属Wolbachia在B型烟粉虱中的检出率较低，并缺少衣原体细菌Candidatus Fritschea bemisiae和类噬胞细菌（CLO），这与我们的结果相似，这些内共生菌的缺失可能与B型烟粉虱的入侵机制相关[4，33]。Chiel等也得到类似的研究结果，即Hamiltonella只能在B型烟粉虱中检测到，而Wolbachia 和 Arsenophonus只能在Q型烟粉虱中检测到，这种关联表明次级内共生菌与烟粉虱生物型存在一定的关系[14]。

通过对B型烟粉虱抗性品系与敏感品系间内共生菌的比较，发现内共生菌Rickettsia、Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella、S247和Prevotella在吡虫啉抗性品系Composite

11BR中的含量明显高于敏感品系Yuma04BS（图2），推测这些共生菌可能与烟粉虱对新烟碱类杀虫剂抗性的形成有关；同时，在烟粉虱对吡丙醚的抗性品系QC02BR中发现共生菌Candidatus HamiltonellaOTU7、Candidatus PortieraOTU85、Candidatus PortieraOTU5、Candidatus PortieraOTU190、RickettsiaOTU4、RickettsiaOTU2的含量明显高于敏感品系1210GadsenBS，认为它们可能与烟粉虱对保幼激素类似物杀虫剂的抗性形成有关。在其他昆虫中也有相关研究表明内共生菌对昆虫抗药性的产生具有一定影响，例如，灰飞虱对杀虫剂的抗性会随着体内共生菌含量的减少而逐渐降低[17]；蚜虫对有机磷类杀虫剂的抗性产生也与其内共生菌有关[34]。相关研究发现，在受到高浓度药剂处理后，昆虫内共生菌的含量会迅速增加[3536]，说明内共生菌在协助宿主对杀虫剂的解毒方面发挥重要作用；点蜂缘蝽Riptortus

pedestris在感染伯克氏菌Burkholderia后，幼虫对有机磷农药的抗性显著提高，这可能是由于伯克氏菌能将高毒的有机磷类杀虫剂水解成低毒活性物质，且该水解产物能够作为碳源直接为宿主提供能量[37]。

本研究通过分析烟粉虱B、Q两种生物型及杀虫剂抗、感品系之间内共生菌种类和数量的差异，认为部分内共生菌可能在烟粉虱生物型分化及抗药性的形成中发挥作用。然而，有研究者指出，由于16S rRNA具有趋同性，通过对烟粉虱内共生菌16S rRNA进行测序分析，推断烟粉虱内共生菌的作用存在着一定的假定性[2]，因此，还需要进一步研究去验证相关内共生菌的功能作用。

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（责任编辑：田 喆）