2024年4月11日发(作者：)

Sourthern杂交技术

摘要：使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入的外源基因的拷贝数。以含

有外源基因的水稻转基因植株叶片为材料，CTAB法少量抽提总DNA，总DNA经限制性

内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上，最后与地高辛标记的探针进行杂交。通过

条带的有无来判断是否为含有外源基因的转基因植物，条带的多少反映了转基因植株中外

源基因的拷贝数。结果：

关键词：抽提 酶切 转膜 探针 杂交

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。该项技术广泛被应用在遗传病检测、

DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现

在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他

方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

1材料与方法

1.1材料及试剂

水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标记系统试剂盒等。

1.2水稻总DNA的少量抽提

CTAB法抽提DNA步骤：

(1) 采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；

(2)

混匀；

取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95ºC以上的1.5CTAB，

(3) 65ºC水浴中放置30分钟以上，每隔5分钟上下颠倒混合数次 (DNase变性，

促进内溶物释放)；

(4) 12000g离心2分钟；

(5) 吸取600l上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下

颠倒混合至下层有机相呈深绿色；

(6) 12000g离心5-10分钟；

(7) 吸取450l上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M

NaAc，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现；

(8) 12000g离心10分钟；

(9) 弃去上清，用500l 75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，12000g

离心5分钟，弃上清,自然干燥；

(10) 加入50lTE（含20g/ml RNaseA），放于4ºC溶解；

(11) 充分溶解后，测定并调整浓度。

1.3总DNA质量检测及酶切

取1l DNA于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（DNA1l +上样缓冲液2l +ddH

2

O7l），

将DNA浓度调节至300-400 ng/l。配制酶切体系20l，其中10l DNA、1l Hind

(10U/µl) 2 l 10×buffer 、7 l ddH

2

O 。混匀，短暂离心；37℃下温浴

1-2小时，加入上样缓冲液终止反应，取1l电泳检测酶切效果。

1.4 琼脂糖凝胶电泳及转膜

盐转移法：

(1)琼脂糖凝胶电泳：1×TAE配制250ml 0.8%的琼脂糖凝胶，点样顺序：marker，

阳性对照，阴性对照，本组样品。

(2)转膜前准备：2个水盘、1根玻璃棒、1块铲胶板、1个切胶刀、2张搭盐桥的滤纸

（13cm×35cm) 、1张合适大小的尼龙膜(7cm×10cm)、2张比尼龙膜稍大的滤纸(7.5cm

×10.5cm)、一叠5cm左右厚的吸水纸(8cm×11cm)、1大1小2块玻璃板；试剂：0.125M

HCl、1.5M NaCl/ 0.5M NaOH 、1.5M NaCl/0.5M Tris、20×SSC

(3) 凝胶的预处理: 电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切

去右上角作为电泳方向记号；把凝胶翻面，放入加有足量的0.125M HCl玻璃盘中，轻轻

摇动约10min，使电泳指示剂溴酚蓝变为黄色为止（脱嘌呤）；倒去HCl溶液，加蒸馏水

漂洗凝胶；倒去蒸馏水，加入足量变性缓冲液（NaOH/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动变性

30min；倒去变性缓冲液，加蒸馏水漂洗；倒去蒸馏水，加入足量的中和缓冲液（Tris/NaCl）

淹没凝胶，轻轻摇动30min中和；倒去中和液，蒸馏水漂洗；20×SSC 中平衡10 min以

上。另一玻璃盘中加入足量的转膜缓冲液(20×SSC)，放上洗净的玻璃板，用2-3张滤纸放

在玻璃板上，两端浸入转膜液中搭制盐桥；在盐桥滤纸上洒些转膜液，立即将胶放在盐桥

上（注意凝胶与盐桥之间不要有气泡），胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（即放

置吸水纸与盐桥相接）；小心将膜覆盖在凝胶上；膜上放2张滤纸，滤纸上放不少于5cm

厚的吸水纸，放上玻板，其上压约350g的重物，转膜过夜

(4)烘膜: 转膜完毕，将膜小心取下，2×SSC 短暂漂洗，用两张滤纸包住膜，置于真空

干燥箱中，80℃固定2 h或120℃ 30min，用EB染胶以检测转移效果。

1.5地高辛标记探针sourthern杂交

(1)地高辛标记探针：10 µl，将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 µ l；沸水

浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却；充分混匀DiG-high Primer

（1#管），并取2 µ l至变性DNA管，混匀并离心；37 ºC温育1小时或过夜；停止反应，

65 ºC加热10分钟。

(2)地高辛标记探针检测：将地高辛标记好的探针系列稀释，点到一条尼龙膜上，同时

用地高辛标记的control DNA作对照标准，120ºC固定30分钟；用地高辛抗体免疫检测，

按NBT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做

正式的杂交。

(3)预杂交与杂交：预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度

37-42 ºC。

预杂交30分钟以上，在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42 ºC下充分润湿。

变性：Dig标记的探针（约25ng/ml）加50µl H2O置沸水浴或98 ºC干浴锅中5分钟后

迅速放在冰上冷却；将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，

避免泡沫；倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液；继续在42 ºC下杂交6h 至

过夜（单拷贝探针）。

(4)洗膜：2×SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次；0.5×SSC，0.1%SDS 65-68℃

温和振荡15分钟，洗2次。

(5)检测：杂交和洗膜后，用Washing Buffer( Buffer1）浸泡1-5分钟；在50ml 1

×Block solution（Buffer2）中温育30分钟；用1×Block solution（Buffer2）稀释抗体

–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）；用20ml antibody solution处理膜30分钟；

用50ml Washing Buffer( Buffer1)洗膜15分钟，洗2次；在10ml detection buffer

（Buffer3）中平衡2-5分钟；在5ml 新鲜配制的color substrate solution中处理膜5

分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在显色过程中摇动；当预期的斑点出现

时，可在50ml水中洗膜5分钟中止反应；结果照像。

2结果与分析

表1 总DNA提取

表2总DNA酶切

表3探针标记检测

表4转膜后检测

表5杂交结果