2024年3月5日发(作者：)

第17卷第11期Vol.17No.11

南方农业SouthChinaAgriculture2023年6月Jun.2023周炀，李剑峰，郭欣杨，等.基于高通量测序的磷石膏上芒草内部细菌多样性分析[J].南方农业，2023，17（11）：25-29.基于高通量测序的磷石膏上芒草内部细菌多样性分析周炀1,2，李剑峰1,2*，郭欣杨1,2，张淑卿1,2，倪明秀1,2，张煜冕3，郭金梅1,2[1.贵州省高等学校生物资源开发利用重点实验室，贵州贵阳550018；2.贵州师范学院喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所，贵州贵阳550018；3.贵州磷化(集团)有限责任公司，贵州贵阳550000]摘要为了探究磷石膏堆渣上野生芒草（MiscanthusSinensis）植株及种子内部微生物组成情况，给今后磷石膏堆渣无害化处理、利用提供一定的依据，以贵州省开阳县露天磷石膏堆场上生长芒草植株及种子为试验材料，通过高通量测序技术分析芒草植株及种子内部微生物多样性。结果共获得123363条有效序列，通过聚类获得274个OTUs，属于17个门42个纲148个属；在门水平上，芒草植属水平上，优势菌属为鞘氨醇单胞菌属细菌（Sphingomonas）、链霉菌属细菌（Streptomyces），分别占7%、2%。关键词磷石膏；芒草；高通量测序；细菌多样性；环境修复文献标志码：ADOI：10.19415/.1673-890x.2023.11.007常强，在各种恶劣环境下都能够生存[5]。目前已有将芒草应用于重金属土壤修复的相关研究报道，并发现芒草能够耐受一种甚至多种高浓度重金属元素的胁迫[6]。贵州作为磷石膏生产排放的集中区域，且磷石膏的产出量在逐年增长，对于磷石膏的有效处理已成为当今贵州乃至全国的热点问题。目前，有关利用芒草植株修复磷石膏堆渣污染的相关研究报道还较为少见，因此具有较大的研究意义。株、种子内部的优势细菌门为蓝菌门（Cyanobacteria_Chlfaxianoroplast），分别占59.03%、79.29%；在中图分类号：X592磷石膏是湿法磷酸生产过程中的副产物，主要成分为二水硫酸钙，除此之外还有部分重金属元素、可溶性磷酸盐及氟化物等杂质[1]。经计算每生产1t湿法磷酸，将排放出约5t的磷石膏废渣[2]。目前，国内对于磷石膏利用率不足40%，大部分是通过堆存方式处理，这种处理方式不仅占据了大量的土地资源，而且其潜在的污染物泄露和垮堆风险也会对当地居民的身体和生态环境造成威胁[3]。磷石膏的低成本处理与有效利用始终是我国磷化工业的一大难题。芒草（MiscanthusSinensis）为禾本科（Gramineae）芒属植物[4]，通常分布在热带、亚热带及温带亚洲地区。芒草在我国分布较广，其对于环境的适应能力非收稿日期：2023-01-03基金项目：全国大学生生命科学竞赛课题（科学探究类〔2022〕〔2022〕031号）；贵州省优秀青年科技人才计划项目（黔科合平台人才〔2021〕5625号)；贵州师范学院首届大学生创新创业训练计划项目（S2）。作者简介：周炀（1999—），男，贵州赤水人，在读本科生。E-mail：*****************。*为通信作者，E-mail：**********************。66770）；贵州省教育厅省级高校科研平台团队滚动支持项目（黔教技1.11材料与方法2021年7月，在贵州省贵阳市开阳县龙景湾贵州材料磷化集团开阳露天堆场（东经106.8523°，北纬27.1513°）采集磷石膏上生长的芒草植株和种子样在0.4～1.2m。1.21.2.125品，采集时芒草呈深绿色，群落单一，株高方法将植株根系挖出，用无菌水清洗表面后放入阴凉样品处理Copyright©博看网. All Rights Reserved.

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南方农业SouthChinaAgriculture2023年6月Jun.2023通风处自然风干，待植株风干后与种子一同装入无菌自封袋内放入4℃冰箱暂存。1.2.2根据试剂盒要求提取样本的DNA，利用1%的琼DNA提取及测序2.12结果与分析2.1.1细菌多样性分析脂糖凝胶电泳测定DNA纯度。采用16SrDNA对于V3-V4引物进行扩增，引物序列为（上游引物338F：如表1所示，样品经过高通量测序共获得124097条测序数据处理结果原始序列，经对原始数据初步处理，获得了123363条有效的序列。供试样本有效序列条数在51383～ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物806R：71980条，其中phps（芒草种子）有效序列条数大于GGACTACHVGGGTWTCTAAT）PCR反应参数：php（芒草植株）。通过聚类一共获得274个OTUS，通a.1×（3minat95℃）b.循环数×30sat95℃；30sat55℃；45sat72℃）c.10minat72℃，10℃untilhaltedbyuser。根据各样品的测序量，将其配置成对用Illumina公司的MiseqPE300，对其进行高通量测序。表1样品PhpsPhpCGGACCTACCACBarcode有效序列数/条5138371980常将相似性值≥97%的序列定义为同一个OTUS。为了比较直观地分析和统计，对于测序样本的共有OTUS和特有OTUS进行分析比较，结果显示，php与phps的共有OTUS有138个，php特有OTUS为66个，phps特有OTUS为70个，即php与phps的微生物群落组成较为相似。应的配比，送至生工（上海）生物工程有限公司，利芒草植株及种子有效序列数据统计碱基数/个2523平均长度/bp406.09405.98最短序列数/条350370最长序列数/条450464注：php代表芒草植株，phps代表芒草种子，下同。2.1.2样品稀释曲线倾斜度在不断降低逐渐趋于平缓（见150OTU数目/个α多样性200芒草植株芒草种子图1），同时样品中测序覆盖度均为1（见表2），说明测序数据量比较合理，基本上能够反映出样品细菌群落的组成情况[7]。通过计算Ace指数、Chao指数、Shannon指数等三个指标结果表明，php细菌多样性大于phps。RankAbundance曲线图能够直观明确地展示各样本中OTUS的均匀度及丰富度，如图2所示，当OTU数量小于100时，php与phps的物种相对丰度较高，但表2样品PhpsPhpOTUs指数204208Shannon指数1.090.98Chao指数295.07291.02Ace指数387.36309.4810000样品数/个60000图1基于OTUS丰度的样品微生物群落稀释曲线芒草植株及种子的细菌α多样性Simpson指数0.430.54Shannoneven指数0.210.18覆盖度1.001.00曲线下降速度比较快，说明php与phps的分布均匀程度较低。当OTU数量超过100的情况下，物种的相对丰度较低，但是曲线比较平坦，表明物种分布较为均衡。图中php与phps样本间的曲线宽度、平滑程度都比较一致，表明其物种丰度及均匀度都无显著差异。2.1.3通过主成分(PCA)分析可知，主成分1(PC1)和主成样本主成分分2(PC2)贡献率分别为58.23%和40.5%，合计为98.73%。如图3所示，两样本点的距离十分接近，且位于第一象限有明显的聚集，表明php与phps的细菌相似性较高。26Copyright©博看网. All Rights Reserved.

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南方农业SouthChinaAgriculture表32023年6月Jun.2023门水平下芒草植株及种子细菌相对丰度表门Php/%59.030.920.230.140.010.040.060.0139.460.080.02Phps/%79.290.440.200.160.000.030.040.0219.710.100.01100.00蓝菌门（Cyanobacteria_Chloroplast）变形菌门（Proteobacteria）1.00丰度厚壁菌门（Firmicutes）拟杆菌门（Bacteroidetes）疣微菌门（Verrucomicrobia）放线菌门（Actinobacteria）酸杆菌门（Acidobacteria）0.01芒草植株芒草种子0100OTU等级200300单糖菌门（Candidatus_Saccharibacteria）浮霉菌门（Planctomycetes）未知菌门（unclassified_Bacteria）其他（Other）100图2基于OTUS水平RankAbundance曲线分析80相对丰度/%60Cyanobacteria_Chloroplastunclassified_BacteriaOther40200芒草种子芒草植株图4图3芒草植株和种子OTU水平PCA图门水平下芒草植株及种子细菌相对丰度图2.2.22.22.2.1细菌群落结构差异分析菌群落结构菌相对丰度属水平下陈化磷石膏上生长芒草植株及种子细门水平下陈化磷石膏上生长芒草植株及种子细在属水平下，共检测出148个属的细菌，在芒草植株中链型植物（Streptophyta59%）占比最大，其次是未知菌属细菌（unclassified_Bacteria39.5%）；鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas0.07%）为植株菌群内部的重要细菌群落，在芒草种子(phps)中占比最大的同样为链型植物（Streptophyta79.2%），其次为未知菌属（unclassified_Bacteria19.8%）。如表4、图5所示，在植株到种子过程中，其内部链型植物、未知菌丰度逐渐增大，但鞘氨醇单胞菌属、链霉菌属等细菌丰度相对减少。链型植物占比较高的原因可能为芒草植株及种子内部叶绿体信息没有被排除，导致测序结果中链型植物数据占了绝大部分。芒草植株之所以能够在磷石膏上生长，原因可能是鞘氨醇单胞菌属、链霉菌属细菌对植物的生长也起着一定的促进作用。鞘氨醇单在门水平下，一共鉴定出17个门类细菌，如表3所示，丰度低于1%的细菌门合并为Others，其中，芒草植株(php)及种子(phps)共有的优势细菌门为蓝菌门(Cyanobacteria_Chloroplast)。如图4所示，蓝菌门细菌在芒草植株、种子内部的相对丰度分别为59%、79.3%，即蓝菌门的相对丰度phps大于php。原因可能较多的营养物质有利于蓝菌门的生长，所以种子内部的蓝菌门丰度较大；2）在细菌功能方面，蓝菌门的菌类具有较强的抗紫外线辐射能力，在较强紫外线的辐射下能够形成一种代谢响应机制，使其适应紫外辐射的胁迫[8]。27是：1）种子相对于植株而言，营养物质积累较多，Copyright©博看网. All Rights Reserved.

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南方农业SouthChinaAgriculture2023年6月Jun.2023胞菌属细菌常被研究者用于修复重金属污染土壤[9]。表4属水平下芒草植株及种子细菌相对丰度表属链型植物（Streptophyta）阿克曼氏菌（Akkermansia）鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）德沃斯氏菌属（Devosia）链霉菌属（Streptomyces）阿里迪杆菌（Aridibacter）慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）未分类细菌（unclassified_Bacteria）其他Other100Php/%58.980.010.070.010.020.0139.461.280.01Phps/%79.220.000.010.000.000.0019.710.910.0080相对丰度/%60Streptophytaunclassified_BacteriaOther注：COG0642:信号转导组氨酸激酶;COG0438:糖基转移酶;COG0745:由CheY样受体域和翼螺旋DNA结合结构域组成的响应调节剂;COG0515:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶;COG4636:蓝藻中保守的未表征蛋白质;COG2226:参与泛醌/甲基萘醌生物合成的甲基酶;COG1357:未表征的低复杂度蛋白质;COG1028:具有不同特异性的脱氢酶（与短链醇脱氢酶有关）;COG0463:参与细胞壁生物发生的糖基转移酶;COG0596:预测的水解酶或酰基转移酶（α/β水解酶超家族）;COG2197:包含CheY样受体域和HTHDNA结合结构域的响应调节剂;COG1309:转录调节剂;COG1595:DNA导向RNA聚合酶特化西格玛亚基，西格玛24同源物;COG2814:阿拉伯40糖外排通透酶;COG0583:转录调节剂;COG2204:含有CheY样受体、AAA型ATP酶和DNA结合结构域的响应调节剂;COG2207:C型DNA结合结构域的蛋白质;COG0451:核苷-二磷酸-糖表异构酶;COG4974:位点特异性重组酶XerD;COG1132:ABC型多药转运系统，ATP酶和通透酶组分;COG0664:cAMP结合蛋白-cAMP依赖性蛋白激酶的分解代谢物基因激活剂和调节亚基;COG1131:ABC型多药运输系统，ATP酶组分;COG1566:多药阻力外排泵;COG0675:转座酶和灭活衍生物;COG0456:乙酰转移酶;COG0673:预测的脱氢酶和相关蛋白质;20COG3293:转座酶和灭活衍生物;COG0265:胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，通常为周质，含有C端PDZ结构域;COG1629:外膜受体蛋白，主要是Fe转运;COG3706:包含类似CheY的接收器域和GGDEF域的响应调节器;COG1943:转座酶和灭活衍生物;COG2319:FOG:WD40repeat雾：WD40重复;COG1136:ABC型抗菌肽转运系统，ATP酶组分;COG0484:具有C端Zn指域的DnaJ级分子伴侣;COG0739:与金属外酯酶相关的膜蛋白;COG0568:DNA导向RNA聚合酶，西格玛亚基（西格玛70/西格玛32）;COG1215:糖基转移酶，可能参与细0胞壁生物发生;COG1012:NAD依赖性醛脱氢酶;COG0577:ABC型抗菌肽转运系统，渗透酶组分;COG0841:阳芒草种子芒草植株离子/多药外排泵;COG1716:FOG:FHAdomain雾：FHA域;COG3119:芳基硫酸酯酶A及相关酶;COG1225:过氧化物恶臭毒素;COG1192:参与染色体分割的ATP酶;COG0589:通用应激蛋白UspA和相关核苷酸结合蛋白;COG3063:毛囊组装蛋白PilF;COG2205:渗透敏感型K+通道组氨酸激酶;COG0633:铁氧化还原素;COG0640:预测的转录调节因子;COG0625:谷胱甘肽S-转移酶。图5属水平下芒草植株及种子细菌相对丰度图2.3如图6所示，在php与phps中，其功能性强的前16s功能预测分析图6COG功能预测热图五类均为：信号转导组氨酸激酶、糖基转移酶、由CheY样受体域和翼螺旋DNA结合结构域组成的响应3讨论与结论本研究以磷石膏上芒草植株和种子为研究对象，调节剂、蓝藻中保守的未表征蛋白质、未表征的低复杂度蛋白质，且种子内部功能丰度值高于植株。其中植株与种子中功能性最强的均为信号转导组氨酸激酶。组氨酸激酶可以作为细菌细胞中的重要信号感知分子，细菌可以利用组氨酸激酶来感受胞外环境的变化，作为一种自身具有激酶、磷酸转移酶和磷酸酶活性的多功能酶，组氨酸激酶能够作为信号分子的细胞受体，且具有跨细胞膜信号转导的功能。这种转导信号在细菌、酵母菌和高等植物中都有发现[10-11]。利用高通量测序技术对微生物多样性进行细致研究，结果显示：在门水平上，其共同的优势菌门是蓝菌门。在属水平上，鞘氨醇单胞菌属细菌（Sphingomonas）、链霉菌属细菌（Streptomyces）为优势菌属，且php中两种优势细菌相对丰度高于phps。这两种细菌在植物生长及抗逆性方面都起着较为重要的作用。黄媛林等对一株红树林链霉菌所产抑菌活性化合物的分离及其生物合成基因簇的研究表明，链霉菌的次生代谢产物具有多种抗性的功效，且多被用作生物防治剂[12]。何晓红等对鞘氨醇单胞菌的各项功能的综述研究表明，28Copyright©博看网. All Rights Reserved.

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南方农业SouthChinaAgriculture2023年6月Jun.2023鞘氨醇单胞菌能够耐受恶劣环境及贫瘠营养环境，且能够促进植物生长与抵抗多种植物病原菌[13]。目前，链霉菌属与鞘氨醇单胞菌属已广泛用于重金属污染的土壤植物与植物促生菌的联合修复研究[14]，微生物环境修复仍然是目前研究的热点问题之一。然而现阶段对于磷石膏的处理利用及其内部元素对于环境污染的系统研究还比较缺乏，这些都将成为未来磷石膏堆渣污染研究的重要课题。芒草植株能够在磷石膏堆渣上面生存的原因可能是由于链霉菌与鞘氨醇单胞菌的存在，这两株细菌具备开发成为磷石膏堆渣治理与利用的植物促生菌的潜在价值，值得进一步开发与研究。参考文献：[1]李东旭,焦嘉伟,廖大龙.我国磷石膏在新型建筑(11):1-4,11.材料行业的发展及思考[J].新型建筑材料,2021,48[6]吴道铭,陈晓阳,曾曙才.芒属植物重金属耐性及生态学报,2017,28(4):1397-1406.其在矿山废弃地植被恢复中的应用潜力[J].应用[7]张守梅,郭玉秋,张娜娜,等.基于高通量测序分析东农业科学,2021,53(12):143-148.玉米浸泡副产物中细菌群落结构和多样性[J].山[8][9]刘荣,于海峰,逄圣慧,等.蓝细菌中紫外吸收物质研究进展[J].食品工业科技,2012,33(11):ementofcadmiumuptakeandaccumulationinSedumalfrediibyendophyticbacteriaSphingomonasSaMR12:Effectsonplant117:androotexudates[J].Chemosphere,2014,[10]陈一.拟南芥跨膜组氨酸激酶ATHK1研究进展[11]高雅,金华燕,付鸣佳,等.蛹虫草组氨酸激酶基因与环境生物学报,2014,20(1):50-55.[J].安徽农业科学,2014,42(7):1923-1924,2036.(CmHK)的序列分析和受蓝光影响的表达[J].应用[2][3][4]龙谨,杨凤龙,吴钦雪,等.磷石膏对土壤的性能影响研究综述[J].广州化工,2021,49(19):35-37.彭晓曦,吴怡,黄祥,等.磷石膏快速干法稳定化的矿物特征研究[J].无机盐工业,2022,54(4):24-28.赵锐名,成小英.铅胁迫下产铁载体细菌对芒草幼93-97.[12]黄媛林,潘信利,陆璐,等.一株红树林链霉菌所产抑菌活性化合物的分离及其生物合成基因簇的研究[J].中国抗生素杂志,2021,46(12):1090-1101.[13]胡杰,何晓红,李大平,等.鞘氨醇单胞菌研究进展[14]陈兆进,林立安,李英军,等.镉胁迫对芒草根际细学,2021,42(8):3997-4004.（责任编辑：丁志祥）[J].应用与环境生物学报,2007(3):431-437.苗的促生特性研究[J].安徽农业科学,2019,47(16):菌群落结构、共发生网络和功能的影响[J].环境科[5]陈许兵,朱广龙,任志强,等.能源植物芒草耐盐性研究进展[J].安徽农业科学,2020,48(13):12-15,20.29Copyright©博看网. All Rights Reserved.