2024年3月5日发(作者：)

研究原著不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力的影响/10.12307.2021.016投稿日期：2020-07-13送审日期：2020-07-13采用日期：2020-08-22在线日期：2020-12-31中图分类号：

R459.9；R394.2；R318文章编号：

2095-4344(2021)25-04032-06文献标识码：B

李 莉1，2，卓 瑾1，2，郑 玲，周 玲，王启松341，2，罗 岚，骆 凯22文章快速阅读：文章特点—△通过体外培养大鼠骨髓来源巨噬细胞，经γ-干扰素和脂多糖联合刺激后高表达M1型细胞表面标记物Nos2，可促进细胞凋亡并且降低细胞的吞噬功能；而经白细胞介素4刺激后则高表达M2型细胞表面标记物Arg1，提高细胞增殖和吞噬能力，抑制细胞凋亡。原代细胞分离培养(1)从SD大鼠骨髓中分离获得骨髓巨噬细胞；(2)通过细胞培养形态学观察、瑞氏染色和流式细胞术对原代细胞进行鉴定。(1)空白对照组；(2)γ-干扰素和脂多糖诱导激活组；(3)白细胞介素4诱导激活组。实验分组观察指标(1)增殖能力；(2)凋亡水平；(3)吞噬功能。文题释义：骨髓源性巨噬细胞：人骨髓来源巨噬细胞分离自骨髓，骨髓细胞中存在未分化的巨噬细胞前体，通过加入巨噬细胞集落刺激因子来分化培养出巨噬细胞。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在适宜条件下可生活两三周，多用做原代培养，难以长期生存。吞噬作用：高等动物具有一些特化的吞噬细胞，包括巨噬细胞和中性粒细胞。它们通过吞噬菌体摄取和消灭感染的细菌、病毒、损伤的细胞、衰老的红细胞。吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。对于其要消灭的对象无特异性，在免疫学中称之为非特异性免疫作用。摘要背景：经典激活巨噬细胞和替代激活巨噬细胞具有不同的表型和功能，目前尚鲜有研究探讨不同诱导方式对骨髓来源巨噬细胞生物学功能的影响。目的：探讨不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响。方法：通过原代细胞形态学观察、瑞氏染色和流式细胞术对体外分离培养的大鼠骨髓来源巨噬细胞进行鉴定。经γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4分别诱导激活24 h，倒置显微镜观察细胞形态，Real time-PCR检测细胞表面标记物Nos2和Arg1的表达，CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡水平，中性红染色鉴定细胞吞噬功能。结果与结论：经γ-干扰素和脂多糖联合刺激的骨髓来源巨噬细胞高表达M1型细胞表面标记物Nos2，可促进细胞凋亡并且降低细胞的吞噬功能；而经白细胞介素4刺激的骨髓来源巨噬细胞则高表达M2型细胞表面标记物Arg1，提高细胞增殖和吞噬能力，抑制细胞凋亡。结果表明，不同诱导极化方式可影响骨髓来源巨噬细胞的生物学行为。关键词：骨髓；巨噬细胞；1型巨噬细胞；2型巨噬细胞；极化；γ-干扰素；脂多糖；白细胞介素4

缩略语：骨髓来源巨噬细胞：bone marrow-derived macrophages，BMMsEffects of different induced polarization methods on the proliferation, apoptosis and phagocytosis of

rat bone marrow-derived macrophagesLi Li1, 2, Zhuo Jin1, 2, Zheng Ling3, Zhou Ling4, Wang Qisong1, 2, Luo Lan2, Luo Kai2Fujian Key Laboratory of Oral Diseases & Fujian Provincial Engineering Research Center of Oral Biomaterial & Stomatological Key Laboratory of Fujian College

and University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China;

2Institute of Stomatology, Fujian Medical University & Center of Oral Tissue Engineering, Fujian Medical

University & Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China;

3Fujian Armed Police Corps Hospital, Fuzhou 350003,

Fujian Province, China;

4Fujian Provincial Governmental Hospital, Fuzhou 350003, Fujian Province, China福建省口腔疾病研究重点实验室，福建省口腔生物材料工程技术研究中心，福建省高校口腔医学重点实验室，福建省福州市

350002；福建医3科大学口腔医学研究院，福建医科大学口腔组织工程研究中心，福建医科大学附属口腔医院，福建省福州市

350002；福建武警总队医院，福建4省福州市

350003；福建省级机关医院，福建省福州市

350003第一作者：李莉，女，1994年生，福建省尤溪县人，汉族，博士研究生，主要从事牙周病方面的研究。

通讯作者：罗岚，硕士，医师，福建医科大学口腔医学研究院，福建医科大学口腔组织工程研究中心，福建医科大学附属口腔医院，福建省福州市

350002/0000-0003-4940-1203(李莉)

基金资助：国家自然科学基金(81870766)，项目负责人：骆凯；福建省科技创新联合资金项目(2016Y9023)，项目负责人：骆凯；福建省卫生计生委青年科研项目(2016-1-72)，项目负责人：罗岚引用本文：李莉，卓瑾，郑玲，周玲，王启松，罗岚，骆凯.

不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力的影响[J].中国组织工程研究，2021，25(25):4032-4037.

1214032

｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月

Li Li, Doctoral candidate, Fujian Key Laboratory of Oral Diseases & Fujian Provincial Engineering Research Center of Oral Biomaterial & Stomatological Key

Laboratory of Fujian College and University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China; Institute of Stomatology, Fujian Medical University & Center of Oral Tissue

Engineering, Fujian Medical University & Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian Province, ChinaCorresponding author: Luo Lan, Master, Physician, Institute of Stomatology, Fujian Medical University & Center of Oral Tissue Engineering, Fujian Medical

University & Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian Province, ChinaAbstractBACKGROUND: Classically activated and alternative activated macrophages have different phenotypes and functions, and there are few studies to explore the

effect of different induction methods on the biological functions of bone marrow-derived macrophages.

OBJECTIVE: To explore the effect of different induced polarization ways on biological behaviors of bone marrow-derived macrophages from S: Rat bone marrow-derived macrophages were isolated and cultured in vitro, and identified by morphological observation, Wright Giemsa staining

and flow cytometry. After being induced and activated by interferon-γ, lipopolysaccharide and interleukin-4 for 24 hours, the morphology of bone marrow-derived macrophages was observed by inverted microscope. The expression levels of cell surface markers Nos2 and Arg1 were detected by real time-PCR. CCK8

assay was performed to determine the proliferation ability of bone marrow-derived macrophages. Flow cytometry was performed to detect the apoptosis, and

neutral red staining was performed to identify the phagocytic function of bone marrow-derived macrophages.

RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow-derived macrophages that stimulated by interferon-γ and lipopolysaccharide were highly expressing the cell surface

marker Nos2 of M1, and apoptosis of bone marrow-derived macrophages can be slightly promoted as well as the phagocytic function of bone marrow-derived

macrophages is reduced; while bone marrow-derived macrophages stimulated by interleukin-4 are highly expressing the cell surface marker Arg1 of M2. Cell

proliferation and phagocytosis of bone marrow-derived macrophages are promoted, and apoptosis of bone marrow-derived macrophages is inhibited. The

results confirm that the biological behavior of bone marrow-derived macrophages can be affected by different methods of induced words: bone marrow; macrophages; type 1 macrophages; type 2 macrophages; polarization; γ-interferon; lipopolysaccharide; interleukin-4Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81870766 (to LK); the Science and Technology Innovation Joint Fund Project of Fujian Province,

No. 2016Y9023 (to LK); the Youth Scientific Research Project of Fujian Health and Family Planning Commission, No. 2016-1-72 (to LL)

How to cite this article: Li L, ZhUo J, ZheNg L, ZhoU L, WANg QS, LUo L, LUo K. Effects of different induced polarization methods on the proliferation,

apoptosis and phagocytosis of rat bone marrow-derived macrophages. Zhongguo Zuzhi gongcheng Yanjiu. 2021;25(25):4032-4037.

0

引言 Introduction既往研究认为，在组织工程骨替代物植入后应尽可能避免引发宿主的免疫反应，但现有的观点认为，工程化植入物应充分利用免疫细胞的免疫反应使其在骨组织修复中发挥积极作用。巨噬细胞是免疫系统中的重要组成细胞之一，也是植入物免疫反应中的主要效应细胞，巨噬细胞的高度异质性使其成为免疫系统中增强骨骼修复和再生的主要靶标[2-3][1]1.3

材料1.3.1

实验动物

同批次4周龄雄性SD大鼠18只，体质量120-150 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005，大鼠饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院比较医学科，环境温度(23±2)

℃，湿度50%-60%，通风良好，12 h白昼和黑夜循环更替，按啮齿类动物标准饲料喂养，自由饮水摄食，适应性喂养1周后进行实验。该实验严格遵循福建医科大学动物伦理委员会准则。1.3.2

实验试剂及仪器 DMEM培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美国)；巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、γ-干扰素(Pepro Tech，美国)；大肠杆菌055:B5的脂多糖、0.05%中性红(Sigma，美国)；链霉素、青霉素、红细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；快速瑞氏-姬姆萨染液(南京建成科技有限公司，中国)；CD11b-FITC及同型对照抗体、总RNA抽提试剂(Invitrogen，美国)；CCK-8(同仁化学研究所，日本)；细胞凋亡检测试剂盒YF®488-Annexin V and PI Apoptosis Kit(苏州宇恒生物科技TM有限公司，中国)；反转录试剂盒PrimeScriptRT reagent Kit

。研究表明，生理状态下的巨噬细胞很容[4]易被激活，机体普遍存在不同亚群的巨噬细胞。目前被学者们广泛认可的激活巨噬细胞的途径包括经典激活途径和替代激活途径，其中由γ-干扰素和脂多糖激活巨噬细胞的途径称为经典激活途径，激活后的巨噬细胞能够提高细胞免疫功能，增强其抗感染、抗肿瘤的能力；由白细胞介素4、白细胞介素13、糖皮质激素、免疫复合物以及白细胞介素10激活巨噬细胞的途径称为替代激活途径，激活后的巨噬细胞能够提高体液免疫功能，增强其抗炎、抗寄生虫的能力，并且有利于组织的修复与再生[5-6]。经典激活和替代激活的巨噬细胞又被称1型巨噬细胞(M1)和2型巨噬细胞(M2)，它们具有不同的表型和功能[7]，目前marrow-derived macrophages，BMMs)生物学功能的影响。该实验通过体外培养大鼠BMMs，比较未激活、γ-干扰素/脂多糖激活以及白细胞介素4激活的BMMs生物学行为的差异，为后续探讨如何调控巨噬细胞使其通过组织工程技术来实现骨组织再生。

with gDNA Eraser、荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM

中国)；HEAL FORCE超净工作台(苏州净化设备有限公司，中国)；生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司，中国)；冷冻高速离心机、细胞培养箱(Heraeus，德国)；倒置荧光相差显微镜(Olympus，日本)；iMARK酶标仪(Bio-Rad，美国)；AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(BD，美国)；实时荧光定量PCR仪(Roche LightCycler 480，德国)。1.4

实验方法

1.4.1

大鼠BMMs的体外分离培养

经腹腔注射氯胺酮

(100 mg/kg)麻醉处死大鼠，参照文献[8]方法于无菌操作下快速取出完整股骨及胫骨，去除附着的骨膜及筋肉，剪除干

Kit(Takara，日本)；引物合成(上海生工工程股份有限公司，尚鲜有研究探讨不同诱导方式对骨髓来源巨噬细胞(bone

1

材料和方法 Materials and methods1.1

设计

细胞学体外实验。1.2

时间及地点

实验于2018年3月至2019年12月在福建省高校口腔医学重点实验室完成。Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜4033

Research Article骺端，DMEM培养液从两端交替冲洗骨髓腔并收集冲洗液，加入适量红细胞裂解液重悬，静置5 min，再次离心，重悬，100 mg/L链霉素及30 μg/L巨噬细胞集落刺激因子的DMEM完全培养液重悬，置于培养箱中常规培养，每3 d更换培养液，倒置相差显微镜下观察并拍照，细胞生长达80%-90%融合时，Real-time PCR检测3组BMMs极化表面标志物基因Nos2和1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬，经细胞筛过滤后离心，Arg1的表达量，以Gapdh为内参。引物序列见表1。表1

｜Real-time PCR反应引物序列及产物大小PBS洗3遍，100 U/mL青霉素、Table 1

｜Sequences of primers used for real-time PCR and product size以含体积分数为10%胎牛血清、基因GapdhNos2上游引物( 5ʹ to 3ʹ)5ʹ-CGG CAA GTT CAA CGG CAC AGT

CAA GG-3ʹ5ʹ-GTT GAC TGT GTT GTT GTG ATT

下游引物( 5ʹ to 3ʹ)5ʹ-ACG ACA ATA CTC AGC ACC AGC ATC

ACC-3ʹ5ʹ-GCC GTG GTT GGA GAG ATA GG-3ʹ以0.25%胰酶+0.02%EDTA消化细胞进行后续实验。

1.4.2

大鼠BMMs的鉴定

(1)流式细胞术检测细胞表面抗原：将大鼠BMMs以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞长至80%-90%融合，以0.25%胰蛋白酶消化，1 000×g离心5 min；

加入PBS重悬，1 000×g离心5min，重复2次；加入PBS重悬，全自动细胞计数仪计数，每个 EP管中加入1×106个细胞；每个EP管中分别加入CD11b-APC及同型对照抗体，并加PBS补足100 μL，4

℃冰箱中避光孵育30 min；1 000×g离心

5 min，弃上清，加入PBS重悬，1 000×g离心5 min，重复2次，去除未结合的抗体；100 μL PBS重悬后上机检测，并使用Flowjo软件对结果进行分析。(2)瑞氏-姬姆萨染色：将大鼠BMMs以1×105个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞贴壁后，40 g/L多聚甲醛于室温下固定20 min，按照瑞氏-姬姆萨染液操作说明：滴加试剂一3-5滴，使其迅速盖满皿底，染色1 min左右；不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二6-10滴，轻摇孔板使染液充分混合，染色5-8 min，水洗30 s，待干后倒置相差显微镜下观察拍照。骨髓来源巨噬细胞的培养及鉴定细胞来源：SD大鼠骨髓培养基：DMEM培养液添加材料：体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素及30 μg/L巨噬细胞集落刺激因子培养时间：培养7 d细胞鉴定：细胞培养形态学观察、瑞氏染色、流式细胞术伦理学批准：实验方案经福建医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为FJMU IACUC1.4.3

大鼠BMMs的诱导极化

使用100 μg/L脂多糖和30 μg/L

γ-干扰素诱导大鼠BMMs向经典活化的M1型巨噬细胞极化(γ-干扰素和脂多糖诱导激活组)；使用10 μg/L白细胞介素4诱导大鼠BMMs向替代活化的M2型巨噬细胞极化(白细胞介素4诱导激活组)；空白对照组大鼠BMMs正常培养。1.4.4

诱导极化后大鼠BMMs的生物学功能

(1)大鼠BMMs表面标记物的表达：将生长状态良好的大鼠BMMs以4×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞长至80%-90%融合，更换极化诱导液(根据1.4.3配制)24 h后，吸弃培养液，PBS清洗3次，采用Trizol提取细胞的总RNA，经反转录合成cDNA。按照试剂盒说明书操作，采用4034

｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月GG-3ʹArg15ʹ-TGT GAA TAC ATC GCA TAA AAG 5ʹ-AAC CGT GAG TTG ACA CTT GAC-3ʹTCA T-3ʹ(2)大鼠BMMs的增殖能力：将大鼠BMMs以3×103个/

孔的密度种于96孔板，待其贴壁后，更换极化诱导液，待大鼠BMMs诱导极化24 h后采用CCK-8检测各组细胞的增殖能力。即取3组细胞各6孔，根据CCK-8试剂盒操作说明，每孔加入200 μL新鲜配置CCK-8溶液，37

℃孵育4 h后用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值。(3)大鼠BMMs凋亡检测：将大鼠BMMs以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞长至80%-90%融合，更换极化诱导液24 h后，对消化后的细胞进行Annexin V和PI染色，并通过流式细胞仪进行检测。(4)大鼠BMMs的吞噬能力：将大鼠BMMs以5×103个/

孔的密度接种于96孔板中，待细胞长至80%-90%融合，更换极化诱导液24 h后，将培养基替换为含有0.05%中性红的PBS，持续30-40 min，待细胞充分染色后，将其洗涤，倒置相差显微镜下观察拍照。然后用1∶1体积混合的乙酸和乙醇溶液裂解细胞，用酶标仪于540 nm波长处测定吸光度值。

1.5

主要观察指标

各组大鼠骨髓巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力。1.6

统计学分析据以-

采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。数x±s表示，采用单因素方差分析，分析前检验各指标数据正态性和方差齐性。P < 0.05为差异有显著性意义。2

结果 Results

2.1

大鼠BMMs的体外分离培养及鉴定

2.1.1

大鼠原代BMMs体外分离培养及形态观察

巨噬细胞集落刺激因子诱导7 d后，倒置显微镜下可见到大量星形的贴壁细胞，部分有伪足和突起。瑞氏-姬姆萨染色结果显示：BMMs形态多样，以圆形为主，但也可见部分梭形、多边形和煎蛋样细胞，边界清晰有突起，细胞核着色较深，呈圆形、卵圆形或者肾形，偏居于细胞一侧；细胞质着色较浅，内含丰富的颗粒状物质，也可见空泡状的结构，见图1。2.1.2

流式细胞术检测细胞表面抗原

由图2可见，细胞表面抗原CD11b阳性率为97.4%，结合倒置显微镜下形态学观察及瑞氏-姬姆萨染色结果，其符合巨噬细胞的特征[8]。2.2

不同表型大鼠BMMs的形态

脂多糖和γ-干扰素处理24 h后的BMMs形态多样，由原本的以圆形细胞为主转变为以多样性细胞为主，大部分细胞伸出伪足，呈棒状、放射状

和树枝状，伪足较为细长，细胞折光性降低。经白细胞介素4处理24 h后的BMMs呈聚集性生长，细胞黏附性增加，体积略微增大，伪足相对较短，见图3。2.3

诱导极化后大鼠BMMs的生物学行为2.3.1

大鼠BMMs表面标记物的表达 Real-time PCR结果显示，经脂多糖和γ-干扰素处理24 h后的BMMs高表达M1型巨噬细胞表面标记物Nos2，而M2型巨噬细胞表面标记物Arg1的表达与未处理组相比没有明显差异。经白细胞介素4处理24 h后的BMMs高表达M2型巨噬细胞细胞表面标记物Arg1，而Nos2则基本不表达，见图4。2.3.2

大鼠BMMs的增殖能力 CCK-8法检测结果显示，经脂多糖和γ-干扰素处理24 h，BMMs的增殖能力与对照组相比没有显著差异；而经白细胞介素4处理24 h后可提高2.3.3

大鼠BMMs的凋亡情况

流式细胞术检测结果显示，脂多糖和γ-干扰素处理24 h均可促进BMMs的凋亡；而白细胞介素4处理24 h则抑制BMMs的凋亡，差异有显著性意义，见图6。2.3.4

大鼠BMMs的吞噬能力

倒置显微镜下观察中性红染色后的未激活、脂多糖和γ-干扰素激活、白细胞介素4激活的BMMs都表现出良好的吞噬活性，经脂多糖和γ-干扰素处理24 h，BMMs的吞噬能力降低，而经白细胞介素4处理24 h，BMMs的吞噬能力较未处理组增加，差异有显著性意义，见图7。生[18]。因此，课题组前期工作的基础上，通过体外培养大[8]鼠BMMs，比较未激活、γ-干扰素和脂多糖激活、白细胞介素4激活的BMMs生物学行为的差异。细胞培养结果显示，所培养的细胞为椭圆形、马蹄形或者不规则形的单核细胞，细胞体形大并可观察到伪足，巨噬细胞集落刺激因子诱导7 d后流式细胞术检测结果显示细胞表面抗原CD11b的阳性率为97.4%，证实所培养的细胞为骨髓来源巨噬细胞[19]。使用γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4分别对BMMs进行刺激，使之分别极化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。倒置显微镜下可见，经γ-干扰素和脂多糖作用后BMMs由原本的圆形细胞为主转变为以多样性细胞为主，大部分细胞伸出伪足，呈棒状、放射状和树枝状，伪足较为细长，细胞折光性降低；而经白细胞介素4作用的较短。虽然Nos2和Arg1均可在活化的巨噬细胞中表达，但二者对L-精氨酸的代谢能力不同，Nos2可以将L-精氨酸代谢为瓜氨酸和一氧化氮，一氧化氮对破坏细胞内细菌DNA特别有效，有利于控制细胞内微生物病原体的复制，在细胞消灭微生物中发挥重要的作用，常作为M1型巨噬细胞的表面标记物之一[20-21]BMMs的增殖能力，与对照组比较差异有显著性意义，见图5。BMMs则表现为聚集性生长，细胞体积略微增大，伪足相对；而Arg1则可以将L-精氨酸代谢为尿素和鸟氨酸，后者通过产生多胺、谷氨酸和脯氨酸对胶原蛋白的合成至关重要，可促进细胞增殖、纤维化和伤口愈合，Arg1主要表达于M2型巨噬细胞中[22-23]。已有研究表明γ-干扰；而白细胞介素4激活素和脂多糖激活的BMMs可增强细胞的抗菌能力，在促进3

讨论 Discussion免疫细胞在骨骼发育和修复中起着至关重要的作用。现有研究认为，免疫细胞(特别是巨噬细胞)的免疫调节作用在利用组织工程技术实现骨修复再生过程中发挥重要的作用[10][9]急性炎症发生中发挥重要作用生[26-27][24-25]的BMMs则可抑制炎症的发生，同时有利于组织的修复和再

。该实验通过Real-time PCR检测发现，经γ-干扰素和脂多糖作用的BMMs高表达Nos2，其Arg1的表达量则未见明显改变，提示BMMs向M1型巨噬细胞极化；经白细胞介素4作用的BMMs则高表达Arg1，其Nos2的表达量显著降低，该结果提示经白细胞介素4作用后BMMs可向M2型巨噬细胞极化。现有研究发现巨噬细胞产生的一氧化氮超过一定范围时，会抑制大多数细胞内病原体或附近细胞的功能或生存

力[28]。研究表明巨噬细胞具有高度异质性，可受细胞所处微[11-12]环境中细胞因子和炎性分子的作用极化为不同的表型。经典激活的巨噬细胞(M1)可分泌促炎因子和活性氧，并且可以迁移到炎症部位，成为宿主防御的一部分；替代激活的巨噬细胞(M2)则可通过产生抗炎细胞因子和吞噬凋亡细胞而在免疫稳态中发挥作用[13]。当前，通过调控巨噬细胞极化[14]对炎性疾病进行防治的相关研究正为学者们所关注。。虽然巨噬细胞通过一氧化氮可抑制线粒体呼吸或细胞[20-21]鉴于M1型巨噬细胞在抗菌活性和M2型巨噬细胞在免疫调节中的作用，极化鉴定机制对于抵抗抗菌素耐药性[5]复制而对宿主起到保护的作用化氮还可以诱导细胞凋亡[29]，并且在某些情况下一氧[30]，但是也有学者指出，巨噬细。该实验通和由免疫介导的病理过程也很重要。研究显示牙周组织中

胞自身也可能会受到其产生的一氧化氮的影响M1型和M2型巨噬细胞水平与牙周组织炎症密切相关，其中M2型向M1型巨噬细胞转换被认为可能是介导牙周组织破坏包括牙槽骨吸收的关键机制之一组织再生修复[16][15]过CCK-8法和流式细胞术检测了未激活和不同方式诱导激活

24 h后BMMs的增殖能力和凋亡水平，结果显示，γ-干扰素和脂多糖激活的BMMs增殖能力未受到显著的影响，但细胞凋亡水平有略微的增加；而白细胞介素4激活的BMMs虽然在细胞增殖方面仅略高于未刺激组和γ-干扰素与脂多糖联合作用组，但在细胞凋亡方面则显著降低，这可能与一氧化氮对BMMs的作用有关。巨噬细胞和嗜中性粒细胞以及树突状细胞一样，是专门。通过调控M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化可以调节组织过度炎症并促进。已有研究开发了新型的靶向药物，通过将[17]M1/M2型巨噬细胞调节至平衡状态来抑制成纤维细胞的过度活化，从而提高特发性肺纤维化疾病的治疗效果。改变M1/M2型巨噬细胞的极化也被认为可以促进牙周组织的再Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜4035

研究原著ABC图注：图中A，B均为巨噬细胞集落刺激因子诱导7 d后骨髓来源巨噬细胞的形态(×40，×100)；C为巨噬细胞集落刺激因子诱导7 d后骨髓来源巨噬细胞的瑞氏-姬姆萨染色情况(标尺：300 μm)图1｜大鼠骨髓来源巨噬细胞原代培养镜下观及瑞氏-姬姆萨染色Figure 1｜Microscopic observation of primary culture of rat bone

marrow-derived macrophages and Wright-Giemsa stainingA107Q10Q20B107Q10Q20.105Q4Q410498.2Q31.751042.6297.4Q3101 103 105

107101 103 105

107IsotypeCD11b图注：图中A为骨髓来源巨噬细胞表面抗原CD11b的同型对照抗体表达；B为骨髓来源巨噬细胞表面抗原CD11b的表达图2｜大鼠骨髓来源巨噬细胞表面抗原CD11b阳性表达Figure 2｜Detection of CD11b positive rate of rat surface antigen of rat

bone marrow-derived macrophagesABC图注：图中A为未处理的骨髓来源巨噬细胞；B为脂多糖和γ-干扰素处理24 h后，由原本的以圆形细胞为主转变为以多样性细胞为主，大部分细胞伸出伪足，呈棒状、放射状和树枝状；C为白细胞介素4处理24 h后，骨髓来源巨噬细胞呈聚集性生长，细胞黏附性增加，体积略微增大，伪足相对较短图3｜不同表型大鼠骨髓来源巨噬细胞的形态(标尺：50 μm)Figure 3｜Morphological observation of rat bone marrow-derived

macrophages with different phenotypes (scale bar: 50 μm)空白对照组γ-干扰素和脂多糖诱导激活组白细胞介素4诱导激活组20aa达aa达15a表表对15对相相10AAN10NRRmm5

5

21sgorN0A0图注：aP < 0.001图4｜不同方式诱导极化的大鼠骨髓来源巨噬细胞表面标记物表达Figure 4｜Expression of surface markers of rat bone marrow-derived

macrophages induced by different induced polarization ways

空白对照组γ-干扰素和脂多糖诱导激活组图注：aP < 0.05白细胞介素4诱导激活组0.5a图5｜不同方式诱导极化的大鼠骨0.4a髓来源巨噬细胞增殖能力值Figure 5｜Proliferation ability of rat

度0.3光bone marrow-derived macrophages

吸0.20.1induced by different induced

0polarization ways4036

｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月A 空白对照组

γ-干扰素和脂多糖诱导激活组

白细胞介素4诱导激活组10Q3-ULQ3-UR10Q3-ULQ3-UR10100.4%5.1%100.1%6.2%10Q3-UL0.2%Q3-UR2.7%PI101010AAA---E10E10E10P10P10P1010101010Q3-LLQ3-LR10Q3-LLQ3-LR10Q3-LLQ3-LR10082.6%11.8%80.5%13.1%10.1%17.0%100101010FITC-A10101010

FITC-A10101010

FITC-A10101010

BAnnexin V8abb空白对照组)%6γ-干扰素和脂多糖诱导激活组(率白细胞介素4诱导激活组亡4凋20图注：图中A为各组细胞PI和Annexin

Ⅴ染色，并进行流式细胞分析；B为各组细胞凋亡率的定量和统计分析，aP < 0.05，bP < 0.001图6｜不同方式诱导极化的大鼠骨髓来源巨噬细胞凋亡情况Figure 6｜Apoptosis of rat bone marrow-derived macrophages induced

by different induced polarization waysA空白对照组

γ-干扰素和脂多糖诱导激活组

白细胞介素4诱导激活组B0.20bac空白对照组干扰素和脂多糖诱导激活组值0.15γ-度白细胞介素4诱导激活组光0.10吸0.050图注：图中A为各组大鼠骨髓来源巨噬细胞吞噬功能比较(中性红染色，标尺：500 μm)；B为吞噬功能的定量和统计分析，aP < 0.05，bP < 0.01，cP < 0.001图7｜不同方式诱导极化的大鼠骨髓来源巨噬细胞吞噬能力Figure 7｜Phagocytic ability of rat bone marrow-derived macrophages

induced by different induced polarization ways的吞噬细胞，其在正常状态下就具有强大的吞噬功能，一方面通过吞噬异物发挥抗感染的作用，另一方面可通过吞噬和传递抗原进而介导适应性免疫应答过程[31-32]。该实验通过中性红染色发现，经典激活和替代激活BMMs在吞噬能力方面存在差异，γ-干扰素和脂多糖激活的M1型BMMs与未激活的BMMs相比，细胞的吞噬能力显著降低，而白细胞介素4激活的M2型BMMs的吞噬能力则有所提高，这与CHEN等[19]的实验结果一致。考虑到M1型巨噬细胞是炎症感染早期主要表达的巨噬细胞类型，而M2型巨噬细胞在组织修复阶段扮演重要的角色，作者推测机体在受到微生物感染的初期，BMMs可吞噬异物并释放促炎物质，这个过程可能会反过来抑制BMMs的吞噬功能，以避免炎症过度反应对机体造成损伤；而在炎症反应的末期，包括白细胞介素4在内的抗炎因子的产生可能是通过提高BMMs的吞噬功能在重建组织稳态方面发挥作用。

结论：经γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4诱导极化后的BMMs形态发生不同改变，经脂多糖和γ-干扰素处

理24 h后的BMMs高表达M1型巨噬细胞细胞表面标记物Nos2，提高BMMs的凋亡水平并且抑制BMMs的吞噬功能；经白细胞介素4处理24 h后的BMMs高表达M2型巨噬细胞表面标记物Arg1，而Nos2则基本不表达，提高BMMs的增殖能力并且抑制其凋亡，促进BMMs的吞噬功能。综上所述，经γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4诱导极化后的BMMs在细胞增殖、凋亡及吞噬能力方面存在差异，如何利用上述差异应用组织工程技术实现骨再生仍需要进一步的深入研究。作者贡献：第一、六、七作者进行实验设计，第一、二作者进行实施，第三作者进行实验评估，资料收集分析为第四、五作者。第一作者成文，第六、七作者审校，第一作者对文章负责。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金(81870766)”“福建省科技创新联合资金项目(2016Y9023)”及“福建省卫生计生委青年科研项目(2016-1-72)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。机构伦理问题：实验方案经福建医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为FJMU IACUC。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。生物统计学声明：文章统计学方法已经通过福建医科大学生物统计学专家审核。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

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approaches to phagocytosis. Rep Prog Phys. 2017;80(12):126601.(责任编辑：MZH，ZN，JY)Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜4037