2024年4月22日发(作者：苹果平板电脑官网商城)

肝癌细胞中IL-18表达及其调控机制的研究

杨贤子;程甜甜;骆志国;蒋飞;柴海霞

【摘 要】Objective This study aimed to investigate the expression of IL-18

and IL-18 regulatory genes in human hepatocellular carcmoma cells and

normal liver cells , than illuminate the possible molecular mechanism of

the regulation of IL-18 in human hepatocellular carcinoma cells. Methods

The normal human liver cell line QSG-7701 surrounding tissue and the

human hepatocellular carcinoma cell lines MHCC97-L and HCCLM3 were

cultured till the exponential phase of growth. RT-PCR was used to detect

mRNA expression of IL-18 and IL-18 regulatory genes in these three cell

lines. Results Compare to two hepatocellular carcinoma cell lines,the

normal human liver cells QSG-7701 expressed high levels of IL-18 and

positive regulatory gene proteinase-3. But there were no significantly

statistical differences in positive regulatory gene caspase-1 and negative

regulatory gene caspase-3 hetween human normal liver cells and

hepatocellular carcinoma cells. Conclusion Altered expression of positive

regulatory gene proteinase-3 may he one of the mechanism of the

regulation of IL-18 in human hepatocellular carcinoma cells.%目的 探讨肝癌

细胞调节IL-18生物学功能的主要分子机制.方法 体外培养正常人类肝细胞株

QSG-7701和原发性肝癌细胞株(MHCC97-L和HCCLM3),采用RT-PCR法,分别

检测这3种细胞株中IL-18及其相关正负调节基因mRNA的表达变化.结果 与2

种原发性肝癌细胞株比较,正常人类肝细胞株中IL-18及其正调节基因粒细胞蛋白

水解酶3(proteinase-3)mRNA表达量较高,但正调节基因caspase-1和负调节基

因caspase-3 mRNA表达水平无统计学差异.结论 原发性肝癌细胞中IL-18

mRNA表达减弱,可能与proteinase-3表达失衡有关.

【期刊名称】《实用癌症杂志》

【年(卷),期】2011(026)005

【总页数】3页(P456-458)

【关键词】肝癌;白介素18;IL-1β转化酶;粒细胞蛋白水解酶3

【作 者】杨贤子;程甜甜;骆志国;蒋飞;柴海霞

【作者单位】442000,湖北省十堰市湖北医药学院附属太和医院;442000,湖北省十

堰市湖北医药学院附属太和医院;442000,湖北省十堰市湖北医药学院附属太和医

院;442000,湖北省十堰市湖北医药学院附属太和医院;442000,湖北省十堰市湖北医

药学院附属太和医院

【正文语种】中 文

【中图分类】R735.7

白介素18(IL-18)具有强烈诱导IFN-γ的能力，能够促进Th1细胞的分化和Th1

细胞因子的产生。无活性的IL-18前体(24 kD)需要经过IL-1β转化酶(ICE，

caspase-1)的剪切才能形成有活性的成熟IL-18(18 kD)[1]。IL-18前体还可以通

过粒细胞蛋白水解酶(PR-3，proteinase-3)的酶切产生活性。但IL-18前体若被

caspase-3剪切则失去生物学活性[2]。近年来研究发现，IL-18通过巨噬细胞、

NK细胞和T细胞产生其他抗肿瘤因子，加强机体对肿瘤的免疫力，在抗肿瘤免疫

调节中备受关注，在临床应用中有重要价值。本研究旨在观察IL-18及其相关的正

负调节基因在正常人类肝细胞和肝癌细胞中表达情况，从而进一步阐述IL-18在人

类肝癌细胞中的作用机制，为原发性肝癌的基因治疗提供新的靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

正常人类肝细胞株QSG-7701(来源于一位女性肝癌患者的癌旁组织)，购自中国科

学院典型培养物保藏委员会细胞库。人类原发性肝癌细胞株MHCC97-L和

HCCLM3，由武汉大学中南医院肿瘤防治研究中心免费提供。这3种人类细胞株

均培养于含10%胎牛血清(杭州四季青生物公司)、100 U/ml青霉素和100

mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中(GIBCO公司)，培养条件为37℃，体积分

数为5%CO2。

1.2 RT-PCR检测细胞株中IL-18及其正负调节基因mRNA的表达

应用Primer Premier 5.0软件，设计目的基因和内参照基因GAPDH的PCR反应

引物。引物序列和PCR反应条件(表1)，均由上海生工生物工程公司合成。QSG-

7701、MHCC97-L和HCCLM3细胞株，均以每瓶2×106个细胞接种于标准的

培养瓶中。当细胞处于对数生长期时，按照Trizol试剂(MRCGENE公司)说明书提

取细胞总RNA，紫外分光光度法检测RNA纯度和浓度后，按照RevertAid First

Strand cDNA Synthesis成套试剂盒(MBI Fermentas公司)操作合成cDNA。为

了确保RNA的提取和逆转录的准确性，所有的cDNA都先要与特异性的寡核苷酸

引物(1种构成性表达的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶，GAPDH)一起进行PCR反应。

PCR反应液的终体积为50 μl，含cDNA 2 μl、10 pmol/μl寡核苷酸引物各1 μl、

10×PCR缓冲液(含Mg2+) 5 μl、dNTP混合液4 μl、DEPC处理水36.75 μl和5

U/μl Taq DNA聚合酶 0.25 μl (TaKaRa公司)。PCR扩增后，取10 μl的扩增产

物在EB染色的2%琼脂糖凝胶中电泳。应用凝胶成像扫描分析系统

(MultilmageTM Light Cabinet，美国Alpha Innotech公司)测定所有条带，应

用AlphaEaseTM v5.5软件，分析所有条带各自峰面积值，定义为该条带的吸光

度值(OD)，而目的基因mRNA的相对表达量，则用目的基因(T)与内参照基因(C)

吸光度值的比率(T/C OD Ratio)表示。实验重复3次。

表1 引物序列表基因引物序列退火温度(℃)(循环数)产物大小(bp)IL⁃18 F：5＇-

TTATTGACAATACGCTTTAC-3＇ R：5＇-CTTGATGTTATCAGGAGGA-3＇

55(30)335ICE F：5＇-CTCAGGCTCAGAAGGGAAT-3＇ R：5＇-

CTGGGACTTGCTCAGAGTGTT-3＇55(30)383Caspase⁃3 F：5＇-

TGGAATTGATGCGTGATGT-3＇ R：5＇-AACCAGGTGCTGTGGAGTA-3＇

55(30)318PR⁃3 F：5＇-CACTGCCTGCGGGACATAC-3＇ R：5＇-

GGTGACCACGGTGACATTGAG-3＇57(30)327

F为正向引物；R为反向引物

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析(one-way

ANOVA)，检验标准取α=0.05。数据用均数±标准差(M±SD)表示。

2 结果

人类肝癌细胞株MHCC97-L和HCCLM3中Th1细胞因子IL-18 mRNA表达水平,

明显低于人类肝细胞株QSG-7701，见图1，且其正调节基因PR-3 mRNA表达

水平也一样，mRNA相对表达量比较同样存在统计学差异( P<0.01和P<0.001)，

见表2。但正调节基因(caspase-1，ICE)和负调节基因(caspase-3)mRNA相对表

达量，2种人类肝癌细胞株和人类肝细胞株间比较无统计学差异(表2)。而在2种

人类肝癌细胞株间，无论是IL-18还是其正负调节基因mRNA的表达水平，均无

统计学差异。

3 讨论

我国是原发性肝癌的发病率和死亡率均较高的国家之一。目前原发性肝癌最常用的

治疗方式是手术、放疗和化疗以及依据病情不同而进行的综合治疗，然而总的治疗

效果并不理想。自从1990年首例基因治疗开展以来，肝癌的基因治疗逐渐成为生

物医学和临床医学的研究热点之一[3]。细胞因子具有直接杀伤肿瘤细胞的能力，

通过刺激机体免疫系统产生强烈的免疫应答,增强机体识别肿瘤细胞的能力，以达

到高效杀伤效应。因此将细胞因子基因(TNF-α、IL-12等)导入肝癌患者体内以达

到抑制和治疗肿瘤的治疗手段在肝癌的免疫基因治疗中有重要地位[4,5]。

IL-18作为Th1细胞因子，主要由单核/巨噬细胞产生的。有活性的成熟IL-18在

人类表皮角质细胞和肺/肠上皮细胞中表达丰富[6]。Wang等[7]发现在正常卵巢

上皮中表达有活性的IL-18，而在卵巢癌组织与细胞系中缺如，这可能是由于不表

达IL-18，或是不共表达ICE。这一类似的现象同样存在人类结肠癌、头颈鳞癌以

及B淋巴细胞癌中[8]。随后对人类卵巢癌细胞进一步的研究发现了1种突变IL-

18，这种突变的IL-18分子上ICE作用位点N端的4个氨基酸缺失，致使其不能

被ICE酶切成熟IL-18，而突变IL-18在正常细胞中并没有被发现，表明这可能是

肿瘤细胞调节IL-18功能的1种机制[9]。

表2 人肝细胞株和2种肝癌细胞株中IL-18及其调节基因mRNA相对表达量细胞

株IL⁃18ICECaspase⁃3PR⁃3QSG-

77010．59±0．023．19±0．152．06±0．130．39±0．03MHCC97-

L0．43±0．03∗∗3．26±0．062．15±0．110．18±0．03∗∗∗HCCLM30．46

±0．04∗∗3．36±0．092．13±0．080．16±0．01∗∗∗

**和***分别为2种肝癌细胞株(MHCC97-L或HCCLM3)与人肝细胞株QSG-

7701比较，**为P<0.01，***为P<0.001

图1 人肝细胞株和2种肝癌细胞株中IL-18及其调节基因表达的RT-PCR结果1

为DNA Marker；2为空白对照组；3为QSG-7701癌旁肝细胞组；4为

MHCC97-L肝癌细胞组；5为HCCLM3肝癌细胞组

Chia等[10]采用免疫组化法，发现肝癌患者癌旁正常肝组织中IL-18表达水平明

显高于肝癌组织。为了进一步的阐明肝癌细胞调节IL-18功能的分子机制，本研究

选用1种来源于肝癌患者癌旁组织的正常肝细胞株和2种原发性肝癌细胞株作为

研究对象，采用RT-PCR，分别检测IL-18及其相关正负调节基因mRNA的表达

情况。研究结果再次从基因水平上证实了，肝癌癌旁正常肝细胞中IL-18 mRNA

表达水平明显高于肝癌细胞。虽然在IL-18主要的正调节基因ICE和负调节基因

caspase-3 mRNA的表达上无明显统计学差异，但与肝癌细胞株相比，癌旁正常

肝细胞株的另一个正调节基因(粒细胞蛋白水解酶，PR-3)mRNA的表达水平较高，

这一结果暗示PR-3表达量的减少，可能是导致肝癌细胞IL-18表达缺失的原因之

一。

综上所述，本研究首次发现在粒细胞蛋白水解酶(PR-3)mRNA的表达上，肝癌细

胞明显低于癌旁正常肝细胞，这可能是肝癌细胞调节IL-18功能的重要机制之一。

本研究结果也暗示IL-18或PR-3可能为基因治疗原发性肝癌提供一个新的潜在的

分子靶点。

参考文献

[1]Bazan JF，Timans JC，Kastelein RA.A newly defined interleukin-1?

〔J〕.Nature，1996，379(6): 591.

[2]Fantuzzi G，Dinarello eukin-18 and interleukin-1 beta: two

cytokine substrates for ICE (caspase-1)〔J〕.J Clin Immunol，1999，

19(1):01.

[3]Kamohara Y，Kanematsu ent of liver cancer: current status and

future prospectives〔J〕.Gan To Kagaku Ryoho，2000，27:987.

[4]Cao G，Kuriyama S，Du P，et te regression of established

murine hepatocellular carcinoma by in vivo TNF-α gene transfer

〔J〕.Gastroenterology，1997，113(2): 501.

[5]Waehler R，Ittrich H，Mueller L，et -dose adenoviral

immunotherapy of rat hepatocellular carcinoma using single-chain IL-12

〔J〕.Hum Gene Ther，2005，16(3): 307.

[6]Okamura H，Tsutsui H，Komatsu T，et g of a new cytokine

that induces IFN-γ〔J〕.Nature，1995，378:88.

[7]Wang ZY，Gaggero A，Rubartelli A，et sion of interleukin-18

in human ovarian carcinoma and normal ovarian epithelium: evidence for

defective processing in tumor cells〔J〕.Int J Cancer，2002，98(6):873.

[8]Lorey SL，Huang YC，Sharma tutive expression of interleukin-

18 and interleukin-18 receptor mRNA in tumour derived human B-cell lines

〔J〕.Clin Exp Immunol，2004，136(3): 456.

[9]Gaggero A，De Ambrosis A，Mezzanzanica D，et al.A novel isoform of

pro-interleukin-18 expressed in ovarian tumors is resistant to caspase-1

and -4 processing〔J〕.Oncogene，2004，23(45):7552.

[10]Chia CS，Ban K，Ithnin H，et sion of interleukin-18，

interferon-gamma and interleukin-10 in hepatocellular carcinoma

〔J〕.Immunol Lett，2002，84(3):163.