2024年3月12日发(作者：predict)

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农业生物技木学报Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２００５　１３　１兰！：塑　二　

・

研究简报・　

苹果６一磷酸山梨醇脱氢酶（ｓ６ＰＤ　基因ｃＤＮＡ克隆及其植物表达载体构建　

粱东，马锋旺¨　张军科．管清美崩｝凌飞　

ｃ西北农林科技走学园　学院，撕凌７Ｉ　２１０（Ｉ）　

关毽词：苹果：６一礴酸ＩＩＩ梨醇脱氧耐（Ｓ６ＰＤＨ）；基因克隆；载体构建　

中围分类号：Ｓ【８８文葡标识码：Ａ文章缩号：Ｉ∞６＿１３０４（２００６）０４－０６３５—０２　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｓｏｒｂｉｔｏｌ－６一Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｓ６ＰＤＨ　ｃＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ａｐｐｌｅ　

ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｔｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　

ＬＩＡＮＧ　Ｄｏｎｇ，ＭＡ　Ｆｃｎｇ—ｗａｎｇ”，ＺＨＡＮＧ　Ｊｕｎ－ｋｅ　ＧＵＡＮ　Ｑｉｎｇ—ｍｅｉ．ＸＵ　Ｌｉｎｇ—ｆｅｉ　

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＨｏｒｔ￣ｃｕＩｌｕｒｅ．Ｎｏｒｔｈｗｅ￣ｌ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｕｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ机Ｖａｎｇｌｉ￣ｇ　７１２１００．Ｃｈｉｎａ）　

Ｋ盯　ａｐｐｌｅ；ｓｏｒｂｉｔｏ［－６一ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ￣（Ｓ６ＰＤＨ）：ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　

山梨醇是一种槠醇，是蔷薇科木本植物主要的光合产物　

及贮运物质．６．磷酸山梨醇脱氯酶（Ｓ６ＰＤＨ）是其台战的关键　

酶（马锋旺和李嘉瑞　１９９３）。近年来．人们利用基罔工程手段　

将Ｓ６ＰＤＨ　ｃＤＮＡ导人烟草（Ｔａｏ　ｅｔ　ａＬ．１９９５）、柿（Ｇａｏ　ｅｔ　，　

９３３　ｂｐ＋编码３１１个氨基酸．与Ｋａｎａｙａｍａ甜ａＪ（１９９２）报道的　

￥ＳＰＤＨ慕因序列摹本一致，仅第４、Ｉ５　２９、４９位密码子分别　

由ＧＧＣ　ＡＴＴ、ＧＡＧ、ＡＡＡ（本文序列）变为ＧＴＣ　ＡＴＣ、ＧＡＡ、　

呻　蠲　

ＡＡＧ（文献序列）．但只有第４位密码子编码的氨基酸由ｔｒ氪　

酸变为缬氨酸，该ｃＤＮＡ序列提交ＧｅｎＢａｎｋ并被收录．登陆　

号为ＡＹ７８６５３９　用试剂盒同收目的基因并与ｐＯＣｍ－Ｔ载体　

２００１忡，发现转基因植物可台成山梨醇，且使转基因植物抗　

性有所提高。本实验旨在从苹果叶片中克隆该基因，井构建　

植物表达载体，为将泼基因转化非蔷蔽科果树提供基本资料、　

连接．连接产物转化太啊杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞．进行蓝白　

斑筛选．碱法提取质牲，酶切鉴定出龠有捕人片断的阳性克　

隆（囝２）并命名为ｐＵＣｍ一阳：　

１材料和方法　

１　１材料　

材料为苹果（Ｍａ　ｐⅢ岫品种皇家嘎扎成熟叶片，取自　

西北农林科技大学园艺学院试验场　大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　

ｃｏｂ）ＤＨ５￣和根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃ￣ｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｔａｃｉ＇ｅｎｓ　ｌＥ—　

ＨＡ　１０５为本实验室保存　

１．２方法　

总ＲＮＡ提取参照候义龙等｛２００２１的方法；质粒拦取　

ＤＮＡ片断Ｉ　收和纯化采用上海生工试剂盒；酶切、连接和重　

组质粒转化大肠杆菌及农杆荫的方法参照文献（－Ｅ关林和方　

宏筠，２００２）　

图１　８６ＰＤＨ基羽ＲＴ—ＰｃＲ产物凝腔电泳　

Ｆｉｇ　Ｉ　Ｔｈｅ￣．ｇａｒｏｓｅ　ｅｌｅｔｒｏ曲ｏｒｅｓｌ￥ｏｆＳ６ＰＤＨ　ｇｅｎｅ　

ＲＴ—ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　

ｌａｍｂｄ￣ＤＮＡ．＇ＥｅＯＲＩ十ｆｌ／ｒｇｌⅢ『　ｅｒ　Ｉ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　

２结果和分析　

２．１基因克隆　

经ＲＴ－ＰＣＲ扩增后得到Ｉ条约９３０　ｂｐ的特异片段ｆ用　

１）＝通过核苷酸测序分析后发现：此基因开放Ｉｊ｝】读脎拿长为　

・基金项目：教育言ｌ；＾尤秀青年教师债助　日资助　

２２植物表达载体构建　

将重组质粒ｐＵＣｍ—ＴＳ用ＫｐｎＩ和日ａ『】｜ＨＩ双酶切后　

作者简介桨表ｃ１９７８－１．男　博上钎究｜ｊ＝＿　

”通讯作者　．ＡＵｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅａｃｅ　Ｅｍａｉｌ：＜ｆｖ．Ｔｆ１６４＠ｓｉｎａ－￣ｏｍ＞　

收ｊ羁日期２００５－０ｔ一【７接受日期：２００５￣２—２Ｉ　

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！　盔　物技术学报——　生　

３根癌农杆菌的转化与鉴定　

收所得小片段定向克隆到经同样双酶切的质粒ｐＧＥｍ－７ｚｆ　

２．

上，挑取抗性菌落井提取质粒．酶切鉴定后得到中间载体　

ｐＧＥｍ－７ｚＰＳ；将ｐＧＥｍ．７ｚ．ｔＳ用Ｘ／ｍ　Ｉ和ＢａｍＨ　ｌ双酶坍后回　

收所得小片段定向克隆到经同样双酶坷质粒ｐＢＩｌ２１上，挑　

将构建好的植物表达载体ｐＢＩＳ采用冻融法导人根癌农　

杆菌ＥＨＡ］０５中．在附加　邪霉素的培养基上筛选，挑取阳　

性克隆，提取重组质粒肘ＰＣＲ进行鉴定（图４）。丹别　非转化　

根癌农杆菌菌液、转化根癌农杆菌菌液、转化农杆菌中提取　

取抗性菌落并提取质粒，进行酶切鉴定（图３），得到与预期大　

小相符的片断，说明Ｓ６ＰＤＨ　ｅＤＮＡ在植物表达载体中连接　

完整且方向正确、并将陔重组质粒命名为ｐＢ１Ｓ　

蕊搿　

的质粒为模板进行ＰＣＲ，结果后两者均特异的ｊｒ增出符合大　

小的片段．前者来扩增Ｈ｛任何片段，说明ｐＢＩＳ已经转化人根　

癌农杆菌中：　

３讨论　

ｌ一　

曹　

～一　

】　

Ｉ　

植物抗渗透胁迫是受多基周控制舯复合遗传性状，与许　

多生理生化过程有关．如小舒子有机渗透剂的合成，蛋白质　

ｌ　■－－一＿’　ｌ　

１　

图２重组质粒ｐＵＣｍ—ＴＳ酶切鉴定　

Ｆｉｇ．２Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆｐＵＣｍ－ＴＳ　血ｒｅｓｌａｆｃｔＪｏｎ　ｅａｄｏｎｕｃｔｅ￣ｅ　

Ｍ．ＬａｍｂｄａＤＮＡ．＇，ＥｅｏＲＩ　Ｈｉｎｄｍｍａｒｋｅｒ；Ｉ．ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＢ衄ＨＩ＋Ｋｐｎ　

２．ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ／＂ｓｔ　Ｉ　

类保护剂的合成等　．山絮醇是一种小舒子多元醇，其生物合　

成的关键酶是６一磷酸山梨醇脱氢酶。当把陔酶的基因转入烟　

跚　

草、柿中并积累ｄｌ梨醇后．转基因植物对盐和旱都有一定抗　

性。这说毗运用关键酶基臣硅行植物遗传改良　提高其抗逆　

性是可行的：我们将使用农杆菌介导法将该基因转人一些非　

蔷薇科果树中，期望培育出具有一定抗性的转基因果树＝　

参考文献　

ＧａｏＭ．Ｔａｎ＆ＭＪｕｒａｋＤａｎｄｅｋａｒＡＭ　ａｎｄ　ＳｕｇｌｕｒａＡ　Ｔｒ￣ｍｓｔｂｒｍａｔｉｎｎ　

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ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＮＰＡ）Ｐ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｏｒｂ　Ｊｔｏｌ￣－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　

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Ｈｏｕ　Ｙ　Ｌ（侯义龙），Ｚｈａｎｇ　Ｋ　ｃｆ张开春）．ｗｕ　Ｌ　Ｐｌ是棘平），Ｈｕ　Ｗ　Ｙ《胡　

图３重组质粒口Ｂｌｓ酶毒ｕ鉴定　

Ｆｉｇ　３　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ［ａｓｍｉｄｐＢＩＳ　ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　

ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓ　

１　ｄｉｇ￣ｔｎｄｐＢＩＳｗｉｈＢａｍＨｌ＋Ａ＇ｔｂｎ１：２，ｄｉｇｅ￣ｅｄ　ｐＢＩ１２１　ｗｉｈＢａｍＨＩ—Ｘ　ｔ

Ｉ：Ｍ，ＩａⅢｂｄａＤＫ　，Ｒｌ十Ｈｉｎｄ　ｍ口Ｉａｒｋ　

文玉）１　Ｌｉｎ　Ｋ（林珂），Ｆｅｎｇ　Ｘ　Ｙ（冯晓元）ａｎｄ　Ｘｉｎｇ　Ｆ　Ｙｆ邢稿有）Ｎｅｗ　

ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｃｘｔｒｌｔｃｔｉｏｒｌ　ｉｎ　ｆｒｕｉｔ　ｔｒｅｅｓ（Ｊ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　

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Ｋａｎａ：ａｔｍａ　Ｙ．Ｍｏｄ　Ｈ．ｋｒｍｓｅｋｉ　Ｈ．ａｎｄ　Ｙａｍａｋｉ　Ｓ　Ｎｕｃｉｅｏｔｉｄ￣ｓｅｑｕｅｎｃｅ　

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Ｃｈｉｎｅｓｅ）　

Ｔａｏ　Ｒ，Ｕｍｔｓｕ　Ｓ　Ｌ　ａｎｄ　Ｄａｎｄｅｋａｒ　Ａ　Ｍ　Ｓｏｒｂ０ｏｌ　ｓ）ａａｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　

ｔｏｂａｃｃｏ　ｗｉｔｈ　ａｐｐｌｅ　ｅＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＮＡＤＰＭｅｐｅｎｄｅｎｔ　

图４转化农杆菌的ＰＣＲ鉴定　

Ｆｉｇ　４　ｌｄｅｎｆｉｉｆｅａｔｉｎｎ　ｏｆｗａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｔｔｍ　｝ｈ　ＰＣＲ　

Ｉ．ｎｏｎ－ｔｍｒ￣ｆｏｒｍｅｄＡｇｒｏｂａ，ｃｔｅｒｌｔｔｍ岵ｔｅｍｐｌａｔｅ；２　ａｎｄ　３　ｔｒａｎ￣ｏｒｍｅｄ　

Ａ￣ｂａｃｔｍ２ｕｎ　ｔｅｍｐｌａｔｅ；４ａｎｄ　５．ｐＭ．￣ｔｉｄ　ｄｒ　ｍｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｇｒｏ６ｎｃ　ｒｅ￣ｕｍ村　

ｓｏｒｂｉｔｏｌ一６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｊ】Ｐｌａ￣ｔ　ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｌ９９５．　

３６（３）：５２５～５３２　

ＷａｎｇＧ　Ｌ（王荚林】ａｎｄ　ＦａｎｇＮ　Ｊ　Ｉ，ｂ－￣筠）ＰｌａｎｔＣｒｏｃｉｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　

（Ｍ）Ｂｄｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐ　辐．２００２（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）　

ｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｍ　！ａｍｂｄａＤＮＰ￣＇ＥｃｏＲ１＋ＨｉｎｄⅢⅢⅡ　四