2024年5月15日发(作者：联想b460e笔记本配置参数)

酵母系列大实验设计

PCR介导的酿酒酵母基因敲除

1、 实验目的

学习理解酿酒酵母中PCR介导的基因一步敲除法的原理，掌握酵

母的转化方法，了解酵母生长及遗传学特性。

2、 实验原理

酵母菌作为最简单的真核生物，能以单倍体和二倍体两种形式稳

定存在，其中单倍体含有两种交配型，可以自由的在单倍体和二倍体

之间进行转换，在生物学研究中有着得天独厚的优势。

首先酵母菌生长速度很快。对数期生长的单倍体菌株在YPD（富

营养天然培养基）90分钟分裂一代，在合成培养基中140分钟分裂一

代。其次，酵母的基因组很小，遗传背景相对简单，是一种很容易进

行遗传操作的模式生物。酿酒酵母的基因组只有12052 Kb,其基因组

序列早在1996年测序完成,已有约6000个超过100个氨基酸的ORF被报

道，只有不到5%的ORF含有内含子，其中有约5700个蛋白编码基因，

分散在16条染色体上。上世纪90年代末，由数个实验室联合进行的酿

酒酵母基因组敲除项目的完成是酵母遗传学研究的里程碑事件。在这

个项目中，四个基因敲除菌株库被成功构建：两种交配型的单倍体菌

株库、杂合子二倍体菌株库以及非必需基因的纯合子二倍体菌株库。

这个项目几乎完成了全部ORF的敲除，为生物学研究，特别是组学研

究，提供了十分强大的系统性研究工具，为后续基因功能的研究奠定

了坚实的基础。此外，酵母作为真核生物，与高等生物在很多代谢通

路和蛋白表达调节等方面是高度保守的，为高等生物相关基因，例如

疾病基因，功能研究具有提供了简单、易于操作的系统。

目前，酿酒酵母已经具有一套十分灵活快速的遗传操作体系。酵

母允许外源质粒以独立复制子游离于基因组之外存在，也允许其整合

到基因组中。但跟其他生物相比，酵母比较独特且强大的特点是外源

序列的整合依赖于同源重组机制。之前提到的基因组敲除项目的完成

就是依赖于高效率的同源重组，如图-1所示。人们利用PCR的方法，

在筛选标记基因两侧引入待敲除基因（YFG，your favorite gene）

特异性序列；随后将PCR产物通过转化传递到酵母细胞内部；在同源