2024年3月5日发(作者：步步高经典广告)

工作汇报

20121031（8:30am-5:40pm）

T7-(Flag)3 PCR扩增片段加“A”尾后，克隆至pMD19T载体，并转化至DH5α感受态细胞。

用T7-pro和pYJ335-R引物鉴定pro-tRNApyl-ter0102&5156连接至pYJ335-T7pylRS和pYJ335-T7pylRS·Flag后的阳性克隆。

取活化后的pCL55-tetR-clpP(98amber)·Flag转化RN4220后的克隆1~3#培养，准备提取基因组DNA鉴定以确认tetR-clpP(98amber)·Flag片段导入到了RN4220基因组上。

取pCL55-tetR-clpP(98amber)·Flag转化RN4220后的克隆#2和Newman(△clpP)菌株培养，准备制备感受态细胞，用于转化pylRS和pro-tRNApyl-ter质粒。

配制0.5M蔗糖溶液。

通过测序正确的质粒pYJ335-T7clpP·(Flag)3质粒PCR扩增获取clpP蛋白S98A mutation片段，DpnI酶切后，转化DH5α感受态细胞。

分析测序结果（测序结果为空载）。

设计引物，准备通过同源重组的方法构建pro·tRNApyl·ter片段至pYJ335-T7pylRS载体。

20121030（8:30am-6:00pm）

提取质粒：pYJ335-T7pylRS-pro·tRNApyl·ter15& pYJ335-T7pylRS-pro·tRNApyl·ter2446&

pYJ335-T7pylRS·Flag-pro·tRNApyl·ter15& pYJ335-T7pylRS·Flag-pro·tRNApyl·ter2446，测定浓度，并送样测序。

重新用T7-pro和pYJ335-R引物鉴定pro-tRNApyl-ter0102&5156连接至pYJ335-T7pylRS和pYJ335-T7pylRS·Flag后的阳性克隆。

分析pYJ335-T7clpP·(Flag)3-10质粒测序结果（序列构建正确）。

转化该质粒至Newman(△clpP)菌株感受态细胞，以期互补该突变体。

用solutionI分别连接pro-tRNApyl-ter0102&5156至pYJ335-T7pylRS和pYJ335-T7pylRS·Flag载体，转化DH5α感受态细胞。

活化pCL55-tetR-clpP(98amber)·Flag转化RN4220后的菌种。

转化pYJ335-T7pylRS·Flag-ptet-tRNApyl-ter质粒至RN4220(ΦtetR-clpP(98amber)·Flag)感受态细胞。

20121029（8:30am-5:30pm）

用引物T7-pro&T0102-R2检测pYJ335-T7pylRS- pro-tRNApyl-ter0102转化DH5α阳性克隆。

用引物T7-pro&M13-F检测pYJ335-T7pylRS- pro-tRNApyl-ter15&2446&5156转化DH5α阳性克隆。

阳性克隆培养过夜，准备提取质粒。

提取pCL55-tetR-clpP(98amber)·Flag质粒至RN4220 1~5#克隆基因组DNA，做PCR鉴定（假阳性克隆）。重新转化pCL55-tetR-clpP(98amber)·Flag质粒至RN4220感受态细胞。

提取质粒pYJ335-T7clpP·(Flag)3-10和pYJ335-T7 (Flag)3-9，测定浓度并送样测序。

保存测序正确质粒的菌种。

20121026（8:30am-6:00pm）

T7-pro和pYJ335-R引物鉴定pYJ335-T7clpP·(Flag)3和pYJ335-T7 (Flag)3阳性克隆。

阳性克隆#10 培养过夜，提取质粒。

EcoRV酶切测序正确的质粒pYJ335-T7pylRS-1和pYJ335-T7pylRS·Flag-5。

电泳检测pro-tRNApyl-ter0102&15&2446&5156和酶切后的以上质粒，将片段分别克隆至酶切后的以上载体，转化至DH5α感受态细胞。

超声处理昨天在Newman(WT)分别在OD600=0.1,0.2,0.4时加入1μg/ml ADEP后，在0,20,40,60,80min获取的菌体。

SDS-PAGE并western blot检测FtsZ蛋白的变化情况（以GAPDH为内参）（FtsZ蛋白在三种情况下各时间点都有，没有因ADEP的存在而加速降解）。

取过夜培养的pCL55-tetR-clpP(98amber)·Flag质粒转化RN4220后的克隆1~5#，离心收集菌体，重悬并用lysostaphin酶解，准备提取基因组DNA，用于鉴定阳性克隆。

20121025（8:30am-6:00pm）

转接Newman(WT)至50ml TSB，分别培养至OD600=0.1,0.2,0.4，分别加入1μg/ml ADEP后，在0,20,40,60,80min时间点各取10ml菌液。

PCR检测及PCR产物回收。

重新用P1314-F&R引物扩增获取pro1314片段，并回收PCR产物。

T7clpP·(Flag)3和T7(Flag)3片段克隆至pYJ335(EcoRV)载体，转化至DH5α感受态细胞。

pro1314片段克隆至pMD19T-EVtRNApyl载体；

ter0310片段克隆至pMD19T-pro0310-tRNApyl载体；

ter1623片段克隆至pMD19T-pro1623-tRNApyl载体；

以上连接产物转化至DH5α感受态细胞。

20121024（8:30am-5:50pm）

提取质粒pMD19T-pro1623-tRNApyl；pMD19T-pro15-tRNApyl-ter15；pMD19T-pro2446-tRNApyl-ter2446；pMD19T-pro5156-tRNApyl-ter5156；pET28b-clpP(Flag)3；pET28b- (Flag)3。

测定浓度，送样测序。

用prime STAR扩增以上质粒，获取pro15-tRNApyl-ter15，pro2446-tRNApyl-ter2446，pro5156-tRNApyl-ter5156，clpP(Flag)3，(Flag)3 片段。

下午组会。