2024年4月10日发(作者：)

纳米氧化锌对 HEK293细胞的毒性作用研究

陈玉莹;韩宏岩

【摘 要】探讨纳米氧化锌浓度和尺寸效应对HEK293细胞的毒性作用以及其产生

毒性的原因。分别用不同浓度的纳米氧化锌（15 nm）和不同尺寸的纳米氧化锌：

常规氧化锌（颗粒直径≤1μm）、15 nm氧化锌、30 nm氧化锌及90 nm氧化锌

处理HEK293细胞，48 h后，MTT检测纳米氧化锌对HEK293细胞活性的影响，

流式细胞仪检测纳米氧化锌对HEK293细胞凋亡的影响，ROS检测试剂盒检测纳

米氧化锌对HEK293细胞中ROS含量的影响。结果显示当15 nm氧化锌浓度小

于2.0μg／mL时，HEK293细胞活性、凋亡率和ROS水平与对照组相比没有明

显差别；但当纳米氧化锌的浓度大于4.0μg／mL时，HEK293细胞活性呈明显下

降趋势，细胞凋亡率和ROS含量呈明显的上升趋势，且在同一浓度下，纳米氧化

锌尺寸越小，HEK293细胞活性越低，细胞凋亡率和ROS含量越高。该结果表明

纳米氧化锌对HEK293细胞的毒性作用呈明显的剂量效应和尺寸效应，纳米氧化

锌诱导HEK293细胞产生的大量活性氧（ ROS）可能是导致其产生细胞毒性的主

要原因之一。%Abstract This experiment explored the effects of

concentration and size of ZnO nanoparticles ( ZnO NPs) on HEK293 cells

and re-search its mechanism of toxicity .In this experiment, three different

sizes ZnO NPs including 15 nm-sized ZnO NPs, 30 nm-sized ZnO NPs, 90

nm-sized ZnO NPs and normal ZnO to treat HEK293 cells were

48 hours, the cell proliferation was detected by MTT test, then a cell

cytometry was made to investigate the rate of apoptosis .Lastly, the

change of ROS level was analyzed by kit . There was no noticeable changes

on HEK 293 cells treated with 15 nm-sized ZnO NPs below 2.0 μg/mL

concentration .While above 4.0 μg/mL, the proliferation of HEK293 cells

was reduced significantly .However the rate of apoptosis and the level of

ROS increased the decrease of the size of ZnO NPs , the

rate of apoptosis and the level of ROS increased , but the proliferation of

cell gradually reduced in HEK293 results suggested that

cytotoxicity of ZnO NPs on HEK 293 cells was related to its concentration

and sing of ROS induced by ZnO NPs may be one important

element of cytotoxicity .

【期刊名称】《生物学杂志》

【年(卷),期】2016(033)001

【总页数】5页(P1-5)

【关键词】纳米氧化锌;HEK293细胞;细胞毒性;细胞凋亡;ROS

【作 者】陈玉莹;韩宏岩

【作者单位】苏州大学基础医学与生物科学学院，苏州215123;苏州大学基础医

学与生物科学学院，苏州215123

【正文语种】中 文

【中图分类】TB383.1;R114

Abstract This experiment explored the effects of concentration and size

of ZnO nanoparticles (ZnO NPs) on HEK293 cells and research its

mechanism of toxicity. In this experiment, three different sizes ZnO NPs

including 15 nm-sized ZnO NPs, 30 nm-sized ZnO NPs, 90 nm-sized ZnO

NPs and normal ZnO to treat HEK293 cells were used. After 48 hours, the

cell proliferation was detected by MTT test, then a cell cytometry was

made to investigate the rate of apoptosis. Lastly, the change of ROS level

was analyzed by kit. There was no noticeable changes on HEK293 cells

treated with 15 nm-sized ZnO NPs below 2.0 μg/mL concentration. While

above 4.0 μg/mL, the proliferation of HEK293 cells was reduced

significantly. However the rate of apoptosis and the level of ROS increased

obviously. With the decrease of the size of ZnO NPs, the rate of apoptosis

and the level of ROS increased, but the proliferation of cell gradually

reduced in HEK293 cells. The results suggested that cytotoxicity of ZnO

NPs on HEK293 cells was related to its concentration and size. Increasing

of ROS induced by ZnO NPs may be one important element of cytotoxicity.

Keywords ZnO nanoparticles； HEK293 cells； cytotoxicity； apoptosis；

reactive oxygen species

纳米氧化锌(ZnO nanoparticles， ZnO NPs)是目前继碳纳米管之后又一个备受关

注的多功能纳米材料[1]。由于晶粒的细微化，其表面电子结构和晶体结构发生变

化，产生了宏观物体所不具有的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效

应以及高透明度、高分散性等特点[2]，而被广泛应用于橡胶、陶瓷、化工、环保、

饲料、电子、化妆品、生物医药等众多领域，具有非常广阔的应用前景[3]。但纳

米氧化锌在创造巨大经济效益的同时，其毒性和健康效应也应引起人们的关注，这

也是保障其健康以及可持续发展的必要条件。然而到目前为止，人们对于纳米氧化

锌与环境以及生物体之间的相互作用与影响还是知之甚少，而且已取得的研究结果

也并不统一，还需要进行大量的研究证明。基于此，本研究以3种不同尺寸的纳

米氧化锌(15 nm、30 nm、90 nm)为对象，研究其对HEK293细胞的毒性作用及

毒性差异，并初步探讨其产生毒性作用的原因，以期为纳米氧化锌做体外安全性评

估，并为纳米材料毒理学以及其生物安全性研究提供一定的理论依据。

1.1 材料

ZnO NPs购自宣城晶瑞新材料有限公司(平均粒径分别为15 nm、30 nm、90

nm，纯度均大于99.9%，结构均为红锌矿晶型)；高糖DMEM(H-DMEM)、胎牛

血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司；双抗(青霉素-链霉素)购自上海

生物工程有限公司；胰蛋白酶(Trypsin)购自Sigma公司；氧化钠(颗粒直径≤1

μm，分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；MTT cell counting kit购自上海

生物工程有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；

Reactive oxygen species assay kit购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 纳米氧化锌悬液的制备

分别配制15 nm、30 nm和90 nm浓度为1 mg/mL的ZnO NPs悬液，混匀后，

超声20 min(振幅80 mm/s，间隔2 s)，然后高压灭菌30 min。在加入到细胞前，

先将ZnO NPs悬液在密封情况下用超声波清洗机超声20 min，最后用细胞培养

液DMEM配制实验所需浓度的ZnO NPs悬液。

1.2.2 HEK293细胞培养

HEK293细胞用含10%胎牛血清和100单位/mL的双抗(青霉素-链霉素)的

DMEM培养基，置于37°C、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞

汇合度达到70%~80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代或制成单细胞悬液接种

于实验所需的96孔板或6孔板中，置于37°C、饱和湿度、5% CO2的细胞培养

箱中培养。

1.2.3 纳米氧化锌对HEK293细胞活性的影响

取处于对数生长期的HEK293细胞，调整细胞密度为5×103个/mL，将其接种于

96孔板，每孔100 μL，设置空白孔(无细胞)和对照孔(有细胞，但培养基内不加

ZnO NPs)；细胞贴壁12 h后，各组分别更换15 nm终浓度为0(对照)、0.5、

1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 μg/mL的ZnO NPs悬液和4.0 μg/mL的常规ZnO、

ZnO NPs(15 nm、30 nm和90 nm)悬液；培养48 h后，按照MTT检测试剂盒

说明操作后，利用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm波长处的光密度OD值；

细胞活力%=(加药细胞OD值-空白孔OD值)/(对照细胞OD值-空白孔OD

值)×100%，以对照组HEK293细胞活性为100%。

1.2.4 纳米氧化锌对HEK293细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的HEK293细胞，以3×105个/mL的密度接种于6 孔细胞培

养板中，每孔体积为2 mL；细胞贴壁12 h后，各组分别更换15 nm终浓度为

0(对照)、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 μg/mL的ZnO NPs悬液和4.0

μg/mL的常规ZnO、ZnO NPs(15 nm、30 nm和90 nm)悬液；培养48 h后，

按照凋亡检测试剂盒说明操作后，流式细胞仪检测分析HEK293细胞凋亡率。

1.2.5 纳米氧化锌对HEK293细胞中ROS含量的影响

取处于对数生长期的HEK293细胞，以3×105个/mL的密度接种于6孔细胞培

养板中，每孔体积为2 mL；细胞贴壁12 h后，各组分别更换15 nm终浓度为

0(对照)、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 μg/mL的ZnO NPs悬液和4.0

μg/mL的常规ZnO、ZnO NPs(15 nm、30 nm和90 nm)悬液；培养48 h后，

按照ROS检测试剂盒说明操作检测HEK293细胞中ROS含量，以对照组

HEK293细胞中ROS含量为100%。

1.2.6 数据统计与分析

实验数据以均数±标准差±s )表示。利用SPSS16.0进行统计分析，P<0.05被认

为差异具有统计学意义。

2.1 纳米氧化锌对HEK293细胞活性的影响

利用MTT分别检测ZnO NPs浓度和尺寸对HEK293细胞活性的影响，结果如图

1和图2所示。由图1可以看出，当15 nm ZnO NPs浓度小于2.0 μg/mL时，

与对照组(ZnO NPs浓度为0 μg/mL)相比，HEK293细胞活性没有明显变化；当

ZnO NPs浓度大于4.0 μg/mL时，HEK293细胞活性开始出现明显的下降趋势。

因此，选用浓度为4.0 μg/mL的ZnO NPs进行纳米尺寸对细胞活性的影响研究，

由图2可以看出，当处理浓度为4.0 μg/mL时，常规ZnO(颗粒直径≤1 μm)组和

90 nm组HEK293细胞活性与对照组(ZnO NPs浓度为0 μg/mL)相比没有明显变

化；而30 nm组HEK293细胞活性下降到80.69%，15 nm组HEK293细胞活性

下降到74.46%，由此可以看出，相同浓度下，15 nm ZnO NPs对HEK293细胞

活性影响最大，其次是30 nm ZnO NPs，90 nm ZnO NPs和常规ZnO对

HEK293细胞活性影响较小。

各组HEK293细胞分别用15 nm ZnO NPs终浓度为0(对照)、0.5、1.0、2.0、

4.0、8.0和16.0 μg/mL处理48 h后，MTT检测各组细胞活性大小。*:P<0.05，

**:P<0.01，表示与control相比有统计学差异。

各组HEK293细胞分别用4.0 μg/mL的常规ZnO、15 nm、30 nm和90 nm

ZnO NPs处理48 h后，MTT检测各组细胞活性大小，对照组ZnO NPs浓度为

0 μg/mL。*:P<0.05，表示与control相比有统计学差异。

MTT实验结果显示，当15 nm ZnO NPs浓度大于4.0 μg/mL时，能明显降低

HEK293细胞活性，且在同一浓度下，ZnO NPs尺寸越小，HEK293细胞活性越

低。

2.2 纳米氧化锌对HEK293细胞凋亡的影响

利用流式细胞仪分别检测ZnO NPs浓度和尺寸对HEK293细胞凋亡的影响，结果

如表1、表2、图3和图4所示。由表1和图3可以看出，15 nm ZnO NPs随着

浓度的升高，HEK293细胞凋亡率呈现明显的上升趋势。由表2和图4可以看出，

当处理浓度为4.0 μg/mL时，HEK293细胞凋亡率：对照<常规ZnO<90 nm

ZnO NPs<30 nm ZnO NPs<15 nm ZnO NPs。

该实验结果显示，ZnO NPs对HEK293细胞凋亡的影响呈明显的剂量效应和尺寸

效应，即15 nm ZnO NPs的浓度越大，HEK293细胞的凋亡率越高；同一浓度

下，ZnO NPs的尺寸越小，HEK293细胞的凋亡率越高。

各组HEK293细胞分别用ZnO NPs(15 nm)终浓度为0(对照)、0.5、1.0、2.0、

4.0、8.0和16.0 μg/mL处理48 h后，荧光分光光度计检测各组细胞中ROS含

量的变化。*：P<0.05，**：P<0.01，表示与control相比有统计学差异。

2.3 纳米氧化锌对HEK293细胞中ROS含量的影响

由图5可以看出，15 nm ZnO NPs随着浓度的升高，HEK293细胞中的ROS含

量呈明显的上升趋势。由图6可以看出，当处理浓度为4.0 μg/mL时，HEK293

细胞中ROS含量：对照<常规ZnO<90 nm ZnO NPs<30 nm ZnO NPs<15 nm

ZnO NPs。

各组HEK293细胞分别用4.0 μg/mL的常规ZnO、15 nm、30 nm和90 nm

ZnO NPs处理48 h后，荧光分光光度计检测各组细胞中ROS含量的变化，对照

组ZnO NPs浓度为0 μg/mL。*：P<0.05，表示与control相比有统计学差异。

ROS检测结果显示，ZnO NPs对HEK293细胞中ROS水平的影响呈明显的剂量

效应和尺寸效应，即15 nm ZnO NPs的浓度越大，HEK293细胞中ROS含量越

高；同一浓度下，ZnO NPs的尺寸越小，HEK293细胞中ROS含量越高。

随着纳米氧化锌的应用越来越广泛，其生物安全性也开始引起人们的关注。但有关

纳米氧化锌的浓度和尺寸对其毒性作用的影响研究还很少。在本研究中，我们利用

MTT和流式细胞仪分别检测了ZnO NPs浓度和尺寸对HEK293细胞活性、细胞

凋亡的影响，结果显示当15 nm ZnO NPs浓度小于2.0 μg/mL时，其对

HEK293细胞活性、细胞凋亡影响不明显，但当15 nm ZnO NPs浓度大于4.0

μg/mL时，HEK293细胞活性明显降低，细胞凋亡率明显升高，且在相同浓度下，

ZnO NPs尺寸越小，HEK293细胞活性越低，细胞凋亡率越高。之前也有研究发

现，ZnO NPs对BEAS-2B细胞[4]、Neuro-2A细胞[5]、SMMC-7721细胞[6]

等细胞活性具有极强的抑制作用且能诱导细胞凋亡，其毒性作用呈明显的剂量-效

应关系。Deng用10 nm ZnO NPs，以15 mg/L的浓度，处理小鼠神经干细胞3

h后，发现有18.24%的NSCs细胞发生凋亡 [7]。ZnO NPs对微生物及动物的毒

性作用的相关研究也显示，ZnO NPs毒性大小与其颗粒的形状和晶体取向没有明

显的相关性，主要取决于其浓度大小，浓度越大，毒性就越强[8-10]。本研究关于

浓度对ZnO NPs毒性作用影响的研究结果与前人的研究结果相一致。除浓度外，

尺寸大小也作为评价纳米材料生物毒性的一个重要参数。理论上来说，纳米材料的

尺寸越小，其相应的毒性应该越强，这是因为纳米颗粒尺寸越小，其比表面积就会

越大，这样单位质量的纳米颗粒具有更大的表面积与生物体接触。但到目前为止，

关于ZnO NPs尺寸对其毒性作用的影响还没有统一的结论，之前有相关研究显示，

ZnO NPs尺寸越小，其抗菌活性越强[11]，但最近也有研究表明，尺寸大小对

ZnO NPs的抗菌活性影响不明显[12]。本研究显示ZnO NPs对HEK293细胞的

毒性作用具有尺寸效应，ZnO NPs尺寸越小，其毒性越强。

ZnO NPs微溶，能够释放一定量的Zn2+，Franklin等在研究ZnO NPs对微藻

类植物的毒性时发现，30 nm ZnO NPs、ZnCl2和块状ZnO对微藻的毒性差异

不大，并证明三者的毒性作用都是因为溶解的Zn2+的作用[13]。除此之外，

Aruoja等的研究也显示，ZnO NPs和块状ZnO对藻类植物的毒性作用和硫酸锌

差异不大，因此他认为在浓度较低时，ZnO NPs的毒性作用主要来自于其溶出的

Zn2+ [14]。然而，Lin等研究发现，ZnO NPs的溶解作用并不是导致ZnO NPs

的植物毒性的主要原因[15-16]。本研究显示，ZnO NPs的毒性明显高于相同浓度

的常规ZnO，因此，推测ZnO NPs的溶解作用并不是导致ZnO NPs对HEK293

细胞毒性作用的主要原因。另外，我们还检测了ZnO NPs对HEK293细胞中

ROS含量的影响，结果显示，HEK293细胞中ROS含量与15 nm ZnO NPs浓度

呈显著正相关关系，而与ZnO NPs的尺寸大小呈明显的负相关关系。由此可推测，

用ZnO NPs处理HEK293细胞后，ROS的过量积累，影响了细胞正常的氧化-抗

氧化水平，诱导HEK293细胞出现氧化应激状态并造成氧化损伤，从而进一步诱

导HEK293细胞发生凋亡。

综上所述，ZnO NPs对HEK293细胞的毒性作用呈明显的剂量效应和尺寸效应，

ZnO NPs诱导HEK293细胞产生的大量活性氧(ROS)可能是导致ZnO NPs产生

细胞毒性的主要原因之一。但有关ROS通过何种途径诱导HEK293细胞发生凋亡

仍需进一步的深入研究。

【相关文献】

[1]张金洋, 宋文华.纳米氧化锌的健康危害与生态安全性研究进展[J].生态毒理学报, 2010, 5(4):457-

468.

[2]Dowling A pment of nanotechnologies[J].Materialstoday, 2004，7(12):30-35.

[3]田静博, 刘 琳, 钱建华.纳米氧化锌的制备技术与应用研究进展[J].化学工业与工程技术, 2008,

29 (2):46-49.

[4]Huang C C, Aronstam R S, Chen D R, et ive stress, calcium homeostasis and

altered gene expression in human lung epithelial cells exposed to ZnO

nanoparticles[J].Toxicology in Vitro, 2010, 24(1):45-55.

[5]Jeng H A, Swanson ty of metal oxide nanoparticlesin mammalian cells[J]. Journal

of Environmental Science and Health, Part A Toxic/Hazardous Substances and

Environmental Engineering, 2006, 41(12):2699-2711.

[6]郭大东.功能化纳米粒子与抗癌药物联合对肿瘤细胞的作用研究[D].南京：东南大学, 2009.

[7]Deng X, Luan Q, Chen W, et al. Nanosized zinc oxide particles induce neural stem cell

apoptosis[J].Nanotechnology, 2009, 20(11):115101.

[8]Zhang L L, Jiang Y H, Ding Y igation into the antibacterial behaviour of

suspensions of ZnO nanoparticles[J].Journal of Nanoparticle Research, 2007, 9:479-489.

[9]Ohira T, Yamamoto O, Iida Y, et cterial activity of ZnO powder with

crystallographic orientation[J].Journal of Materials Science:Materials in Medicine, 2008,

19(3):1407-1412.

[10]Wang B, Feng W Y, Wang M, et toxicological impact of nano-and submicro-

scaledzinc oxide powder on healthy adult mice[J].J Nanoparticle Research, 2008,

10(2):263-276.

[11]Yamamoto nce of particle size on the antibacterialactivity of zinc oxide

[J].International Journal of Inorganic Materials, 2001, 3(7):643-646.

[12]Adams L K, Lyon D Y, Alvarez P J ative ecotoxicity of nanoscale TiO2, SiO2,

and ZnO water suspensions[J].Water Research, 2006, 40(19):3527-3532.

[13]Franklin N M, Rogers N J, Apte S C, et al. Comparative toxicity of nanoparticulate ZnO,

bulk ZnO, and ZnCl2 to a freshwater microalga(Pseudokirchneriella Subcapitata):the

importance of particle solubility[J]. Environmental Science and Technology, 2007,

41(24):8484-8490.

[14]Aruoja V, Kahru A, Dubourguier H ty of ZnO, TiO2 and CuO nanoparticles to

microalgae Pseudokirchneriella subcapitata[J].Toxicology Letters, 2008, 180: 220.

[15]Lin D, Xing oxicity of nanoparticles:inhibition of seed germination and root

growth [J].Environmental Pollution, 2007, 150(2):243-250.

[16]Lin D, Xing uptake and phytotoxicity of ZnO nanoparticle[J]. Environmental

Science & Technology, 2008, 42(15):5580-5585.