2024年4月10日发(作者：)

重庆医学２０１８年１月第４７卷第２期　

１４５　

・

论　著・ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—８３４８．２０１８．０２．００１　

外源性ＮＰＭ突变蛋白对ＡＫＴ细胞定位的影响及其　

对白血病增殖的意义　

全静　，王　

春　，李宝林　，刘靳波　

（１．西南医科大学附属医院检验科，四川泸州　６４６０００；２．四川省泸州市中医医院检验科　６４６０００）　

［摘要］　目的探讨外源性核仁磷酸蛋白Ａ型突变体（ＮＰＭ　ｍＡ）对蛋白激酶Ｂ（ＡＫＴ）的亚细胞定位的影响及其对白血病　

细胞增殖的意义。方法　免疫共沉淀实验检测ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ的相互作用；免疫荧光实验观察ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ的亚细胞定　

位，ＣＣＫ－８法检测细胞增殖能力。结果　Ｋ５６２细胞中，ＮＰＭ　ｍＡ能够与ＡＫＴ结合。免疫荧光显示，ＮＰＭ　ｍＡ主要分布于细胞　

质，当共同转染ＮＰＭ　ｍＡ和ＡＫＴ到ＨＥＫ２９３Ｔ细胞后，ＡＫＴ由弥散分布转移至细胞胞质。另外，Ｋ５６２　ｍＡ组（突变组）细胞在　

７２　ｈ时较Ｋ５６２　ｃｌ组（空载体转染对照组）和Ｋ５６２　ｗｔ组（野生组）体外增殖能力明显增强（Ｐ＜Ｏ．０１）。ＡＫＴ抑制剂（ＡＫＴ　ｉｎｈｉｂｉ—　

ｔｏｒ　１Ｖ，ＡＫＴⅣ）处理４８　ｈ后，Ｋ５６２　ｗｔ组和Ｋ５６２　ｃｌ组增殖被明显抑制，Ｋ５６２　ｍＡ组仍能维持生长（Ｐ＜Ｏ．０１）。结论　外源性　

ＮＰＭ　ｍＡ能够改变ＡＫＴ的亚细胞定位，且调控白血病细胞的体外恶性增殖。　

［关键词］白血病；蛋白激酶类；核仁磷酸蛋白；细胞定位　

［中图法分类号］Ｒ７３３．７１　［文献标识码］　Ａ　［文章编号］　１６７１—８３４８（２０１８）０２—０１４５—０４　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ＮＰＭ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｎ　ＡＫＴ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　

ＱＵＡＮ　Ｊｉｎｇ　，Ｗ＿ＡＮＧ　Ｃｈｕｎ。，ＬＩ　Ｂａｏｌｉｎ　，ＬＩＵＪｉｎｂｏ　

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｅ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｕｚｈｏｕ，　

Ｓｉｃｈｕａｎ　６４６０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ　ｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｕｚｈｏｕ　Ｔｒ口ｄｉｔｉｏｎａｌ　

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｕｚｈｏｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ　６４６０００，Ｃｈｉｎａ）　

［ＪＡｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ＮＰＭ　ｍＡ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＫＴ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｉｇｎｉｆｉ—　

ｃａｎｃｅ　ｊｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｊｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｂｅ　ｃｏ—ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｊｎｔｅｒａｃｔｌ　ｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　

ＮＰＭ　ｍＡ　ａｎｄ　ＡＫＴ　．Ｔｈｅ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＰＭ　ｍＡ　ａｎｄ　ＡＫＴ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．　

Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｗａｓ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ＣＣＫ－８　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＮＰＭ　ｍＡ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＫＴ　ｉｎ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　

ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ。ＮＰＭ　ｍＡ　ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ａｆｔｅｒ　ｃｏ—ｔｒａｎｆｅｃｔｉｎｇ　ＮＰＭ　ｍＡ　ａｎｄ　ＡＫＴ　ｉｎｔｏ　

ＨＥＫ２９３Ｔ　ｃｅｌｌｓ，ＡＫＴ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｔｏ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍａ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ　ｉ　ｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　

ａｔ　７２　ｈ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｋ５６２　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｋ５６２　ｅｌ　ａｎｄ．Ｋ５６２　ｍＡ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０１）．Ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　

ｗｉｔｈ　ＡＫＴ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＡＫＴ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒⅣ，ＡＫＴ　ＩＶ）ｆｏｒ　４８　ｈ，ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　　ｔｈｅ　Ｋ５６２　ｃｌ　ａｎｄ　Ｋ５６２　ｗｔ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗａｓ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ　ｉｎ—　

ｈｉｂｉｔｅｄ，ｂｕｔ　ｗｈｉｃｈ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｋ５６２　ｍＡ　ｇｒｏｕｐ　ｃｏｕｌｄ　ｓｔｉｌｌ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ＮＰＭ　ｍＡ　ｃａｎ　ｄｈａｎｇｅ　ｔｈｅ　

ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＫＴ，ｍｏｒｅｏｖｅｒ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｕｋｅｍｉｃ　ｃｅｌｌｓ．　

［Ｋｅｙ　ｗｏｒ￣］ｌｅｕｋｅｍｉａ；ｐｒｏｔｅｉｎ．ｋｉｎａｓｅｓ；ｎｕｃｔｅｏｐｈｏｓｍｉｎ；ｃｅｌｌ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　

核仁磷酸蛋白（ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ，ＮＰＭ）主要定位于细胞的　的相互关系，以及ＮＰＭ　ｍＡ对ＡＫＴ的亚细胞定位的影响，并　

核仁颗粒区，属核质穿梭蛋白，它广泛存在于各种组织细胞中，　

进一步观察ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ对白血病细胞增殖的意义，从　

结构高度保守，是一种重要的伴侣分子［】］。Ａ型突变（ＮＰＭ　

而深入认识ＮＰＭ突变蛋白在自血病发生、发展中的机制。　

ｍｕｔａｎｔ　Ａ，ＮＰＭ　ｍＡ）是ＮＰＭ最为常见的突变类型，占７５　～　

１材料与方法　

８０　ｌ＿２］。白血病是一组造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，在　

１．１　质粒与细胞　ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＭＳＣＶ－Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｗｔ　

治疗上具有明显的异质性，ＮＰＭ突变在临床上与白血病发生　

和ＭＳＣＶ－Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｍＡ质粒由美国圣犹大儿童研究医院惠　

发展密切相关［３］。研究表明，突变后的ＮＰＭ蛋白可携带抑癌　

赠，ＨＡ—ＡＫＴ、ｐＥｎｖｅｌｏｐｅ和ｐＨｅｌｐ质粒由美国安德森癌症研　

蛋白ｐｌ９ＡＲＦＥ４］、ＮＦ－ｋａｐｐａ　Ｂ　５］、ｃ—ｍｙｃ［　等核内蛋白发生胞质　

究中心惠赠，人慢性粒细胞白血病细胞株Ｋ５６２和人胚肾　

移位，通过影响其稳定性从而促进白血病细胞的恶性增殖。白　

ＨＥＫ２９３Ｔ细胞株购于中国科学院上海细胞库。　

血病发生、发展中存在蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ，ＡＫＴ）信　

１．２药品与试剂胎牛血清（ＦＢＳ，上海普飞生物技术有限公　

号通路的过度激活，与白血病细胞存活、转化和黏附等生物学　司）；ＲＰＭＩ　１６４０、ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ—ＢＲＬ公司）；Ｌｉｐｏ—　

功能密切相关口］。本研究旨在探讨外源性ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ　

ｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；兔抗人ＮＰＭ　ｍＡ单克隆抗　

＊　基金项目：西南医科大学附属医院项目（２０１５一ＱＳ－００８）；四川省泸州市科技局（１５１９３）；四川Ｉ大学与泸州市人民政府战略合作项目　

（２０１３￣ＤＬＺ－Ｓ１５）。　作者简介：全静（１９８８一），检验技师，硕士，主要从事血液肿瘤研究。　

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重庆医学２０１８年１月第　４７卷第２期　

于５　ＣＯ　的３７℃恒温培养箱中培养２４　ｈ后弃去培养液，用　

ＰＢＳ轻轻洗３次，４　多聚甲醛固定２０　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次。　

０．１　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００透膜１０　ｍｉｎ，用１Ｏ　山羊血清室温封闭３Ｏ　

体（Ａｂｃａｍ公司）；小鼠抗人ＮＰＭ单克隆抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ／Ｇ　

ｂｅａｄｓ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司）；小鼠抗Ｆｌａｇ标签抗体、小鼠抗ＨＡ标　

签抗体、兔抗人ＡＫＴ单克隆抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公　

司）；小鼠抗人３－ａｃｔｉｎ单克隆抗体、ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ、　

Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ＠５９４山羊抗鼠ＩｇＧ、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗　

（北京中杉金桥公司）；苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）蛋白酶抑制剂　

（德国Ｒｏｃｈｅ公司）；ＡＫＴ抑制剂（ＡＫＴ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＶ，ＡＫＴ　ＩＶ；　

Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ公司）；ＣＣＫ８试剂盒（上海碧云天生物技术有限　

公司）。　

１．３方法　

ｍｉｎ，加封闭液稀释的单克隆一抗（１：ｉｏｏ）置４℃冰箱过夜。　

ＰＢＳ洗３次，加入荧光标记的二抗（１：２００），３７℃避光孵育１　

ｈ，ＰＢＳ洗３次后４　６一二脒基一２一苯基吲哚（ＤＡＰＩ）避光染色５　

ｍｉｎ，最后用甘油封片。荧光显微镜下观察荧光信号的分布　

情况。　

１．３．６　ＣＣＫ一８法检测细胞增殖能力　收集转染后的各组　

Ｋ５６２细胞，分别用低剂量ＡＫＴ　ＩＶ或者等剂量二甲基亚砜　

（ＤＭＳ０）处理白血病细胞，制成细胞悬液接种于９６孔细胞培　

１．３．１细胞培养　ＨＥＫ２９３Ｔ细胞用含１０　ＦＢＳ的ＤＭＥＭ　

培养基，Ｋ５６２细胞用含１Ｏ　ＦＢＳ的ＲＰＭＩ　１６４０培养基，培养　

养板中，每组设３个复孔，５　ＣＯ。的３７℃恒温培养箱孵育，　

于５　ＣＯｚ的３７℃恒温培养箱中，取对数生长期的细胞进行　

培养０、１２、２４、３６、４８、６０、７２　ｈ每孑Ｌ加入１Ｏ　Ｌ　ＣＣＫ一８（５　ｒａｇ／　

实验。　

ｍＬ）溶液，继续培养１　ｈ，在Ａ４５０　ｎｍ波长处测量各孔的光密　

１．３．２细胞转染　已知ＮＰＭ１基因是杂合性突变，人Ｋ５６２　

度（ＯＤ）值。以０Ｄ值为纵坐标，时间为横坐标用Ｓｉｇｍａ—　

和ＨＥＫ２９３Ｔ细胞株均存在野生型ＮＰＭ蛋白，不存在ＮＰＭ　

Ｐｌｏｔｌ２．０软件绘制生长曲线。　

ｍＡ。本研究中Ｋ５６２细胞设立空载体转染对照组（Ｋ５６２　ｃ１）、　

１．４统计学处理　采用ＳＰＳ８１６．０软件进行数据分析，计量　

野生组（Ｋ５６２　ｗｔ）和突变组（Ｋ５６２　ｍＡ）。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ—　

资料用　±５表示，比较采用配对样本ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差　

ｎｅＴＭ２０００转染试剂将空载体ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ：ＧＦＰ（ｖｅｃｔｏｒ）和实　

异有统计学意义。　

验质粒ＭＳＣＶ－Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　Ｗｔ（Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｗｔ）、ＭＳＣＶ－Ｆｌａｇ—　

２结　果　

ＮＰＭ　ｍＡ（Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｍＡ）连同ｐＥｎｖｅｌｏｐｅ及ｐＨｅｌｐｅｒ辅助载　

２．１　Ｋ５６２细胞中ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ的相互关系分别转染　

体分别共转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞。培养６　ｈ后更换含有１Ｏ　

ｖｅｃｔｏｒ、Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｗｔ、Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｍＡ于Ｋ５６２细胞中，采用　

ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基，于２４、４８　ｈ收集上清液，经０．４５“ｍ滤　

Ｃｏ—ＩＰ检测ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ的结合作用。用抗ＡＫＴ的单克　

器过滤收获病毒液。将Ｋ５６２细胞接种于６孔板，加入制备好　

隆抗体沉淀蛋白复合物后电泳转膜，用Ｆｌａｇ抗体进行免疫印　

的病毒液，同时加入终浓度为８　ｍｇ／ｍＬ的聚凝胺，扩大培养进　

迹分析。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果表明，Ｋ５６２　ｍＡ组在相对分子量　

行后续实验。　

３２×１Ｏ。附近检测到ＮＰＭ　ｍＡ蛋白，见图１。上述结果提示　

１．３．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ收集细胞，用含１００　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ的　

Ｋ５６２细胞中ＮＰＭ　ｍＡ蛋白能与ＡＫＴ结合。　

细胞裂解液ＥｌＯ　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ盐酸（ｐＨ　７．４），５　ｍｍｏｌ／Ｌ乙二　

Ｐ　

胺四乙酸（ＥＤＴＡ），１５．０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，１　曲拉通Ｘ－１００　

Ｋ５Ｂ２　ｌ（５６２＿ｒｔ　Ｉ（５８２　ｍ　

（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００），２５０　ｍｍｏｌ／Ｌ原钒酸盐，２０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｂ－甘油磷　

Ｂ　

ＦＩａｇ－ＮＰ＿ｌＩｌ＾　

酸］充分裂解提取细胞总蛋白。取６Ｏ　ｇ蛋白用１２　十二烷基　

硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分离，通过湿转法　

将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜上，５　脱脂奶粉常温　

ＦＩａｒＮＰ蝴ｍ＾　

封闭２　ｈ后加一抗（１：２　０００稀释）４℃孵育过夜，Ｔｒｉｓ盐酸吐　

温缓冲液（ＴＢｓＴ）洗涤１０　ｍｉｎ×２次，Ｔｒｉｓ盐酸缓冲液（ＴＢＳ）　

＾Ｉ（Ｔ　

洗涤１０　ｍｉｎ，加二抗（１：１　０００稀释）室温孵育１　ｈ，洗涤后用　

化学发光显色试剂进行显色。实验设Ｇ一肌动蛋白（３－ａｃｔｉｎ）为　

Ｂ—ａｃｔｉｎ　

内参，结果采用Ｑｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ软件进行分析。　

１．３．４免疫共沉淀（Ｃｏ－ＩＰ）　收集细胞，提取总蛋白，将细胞　

Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测Ｃｏ：ＩＰ蛋白复合物中的ｆｌａｇ－ＮＰＭ　ｍＡ蛋白，　

裂解液用ＥＩＡ试剂［Ｏ．１　ＮＰ一４０，５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　

ＷＣＥ：全细胞裂解液　

７．５），２５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ］定至１　ｍＬ体积，加　

图１　外源性ＮＰＭ、ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ的相互作用　

入１，ｕｇ抗ＡＫＴ的单克隆抗体，４℃缓慢旋转孵育过夜。次日　

２．２　外源性ＮＰＭ　ｍＡ对ＡＫＴ亚细胞定位的影响　在　

加入５Ｏ　Ｌ　Ｐｔｏｔｅｉｎ　Ａ／Ｇ磁珠（ｂｅａｄｓ），４℃缓慢旋转孵育４　ｈ，　

ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中分别转染ＨＡ－ＡＫＴ和Ｆｌａｇ－ＮＰＭ　ｍＡ，荧光　

３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ，将ｂｅａｄｓ离心至管底后弃上清。用　

染色后观察目标蛋白在细胞中的分布情况。结果显示，转染　

ＥＩＡ试剂反复清洗ｂｅａｄｓ，３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ去除上清　

ＨＡ—ＡＫＴ的２９３Ｔ细胞，细胞核和细胞浆可见很强的ＨＡ—　

液，再用３Ｏ　Ｌ　２倍浓度的上样缓冲液重悬，９５℃煮沸５　ｍｉｎ　

ＡＫＴ特异性荧光，转染Ｆｌａｇ－ＮＰＭ　ｍＡ的２９３Ｔ细胞在细胞核　

使蛋白复合物变性，１３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ取上清进行ＳＤＳ－　和细胞浆均可见荧光信号，而荧光信号主要集中于细胞胞质区　

ＰＡＧＥ　

域，见图２Ａ。此外，共同转染Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｍＡ和ＨＡ—ＡＫＴ到　

１．３．５免疫荧光取转染后的ＨＥＫ２９３Ｔ细胞制备成１×１Ｏ　

ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，发现带红色荧光的ＮＰＭ　ｍＡ主要分布于细　

的单细胞悬液，取１００　ｐ．Ｌ接种于１２孔板中的灭菌盖玻片上，　

胞胞质区域，而带绿色荧光的ＡＫＴ蛋白也在细胞的胞质区域　

皇　垦芏　±　旦箜　！查箜　塑　

●　

１４７　

，　

２　

，

Ｏ　

Ｏ　

８　

Ｏ　

６　

０　

４　

０　

２　４　

ＨＡ—ＡＫＴ　ＤＡＰ　

ＭＥＲＧＥ　

ＤＡＰ　

ＭＥＲＧＥ　

Ａ　

固　

Ａ：Ｈ　Ｋ　’细胞中Ｆｌａｇ　Ｎｔ　Ｍ　ｍＡ和ＨＡ—ＡＫ．ｒ赞ｎ的亚细胞定位；Ｉ３：共　转染　Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｍＡ和ＡＫＴ蛋ｈ的、　细胞定ｆ、）＝；ＨＡ　ＡＫＴ、　

Ｆｌａｇ—ＮＰＭ　ｎ１Ａ‘　红色荧光。ＡＫＴ呈绿色荧光．细胞核Ｉ）ＡＩ　Ｉ染色呈蓝色荧光．ＭＥＲＧＥ为融合　像　

图２　外源性ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ的亚细胞定位（×４００）　

累积，提爪移化到胞质的ＮＰＭ突变蛋自可能ｔ　ＡＫＴ蛋白共　

ＩＹ处理　各　钏胞的体外增殖能力．　发观．　ｌ８　ｈ后Ｋ５６２　

同定位于胞质『｝Ｉ．　【挈】２Ｂ。　

ｗｔ组和Ｋ５６２　ｌ组体外增殖能力叫　被抑制．Ｋ５６２　ｍＡ组细　

胞仍能维持，卜Ｋ，差异有统计学意义意义（Ｐ＜０．０Ｉ），见　３Ｂ　

３讨　论　

Ｎｆ　Ｍ　突变对白血痫细胞的恶性转化ｊＩ　重要调控作　

ｂ　

ｊ　

』ｆｊ　。ＮＡＫＡ（；ＡＷＡ等　提ｍ．ＮＩＪＭ（’术端　瓴酸对ＮＩ　Ｍ　

苫　

苫　

：　

的核　定化起　婴作用，突变的　Ｉ　Ｍ（’术端仃　额外的ＮＥＳ　

、—　

｛　

核输　序列．¨ｊ‘导敛ＮＰＭ移位到细Ｉ也胞质。　Ｉ，Ｍ突变并胞　

、．

士Ｈ　

‘　

质移位后．ＡＲＦ　ｐ５３的稳定性降低．癌蚩｝　Ｉ　ｌ＇￣ｙｃ活性增强从　

靛　

而导敛细胞　增殖　…。Ｕ前的机制研究多集中ｆ　ＮＰＭ　

＾　时间（ｈ）　Ｂ　时间（ｈ）　

突变后刈核ｆ：货ｒｊ活性的改变，聚积　胞质【Ｉｌ的ＮＰＭ对胞质　

Ａ：（、（、Ｋ　８法榆测转染后各组Ｋ５６２细胞的体外增　能力，ｗｅ　

赁　的影响少有报道。ＡＫＴ是调　造血的【ｆｌ央楸纽，川‘以通　

Ｐｒｎ　ｂｌｏｔ圈为转染　Ｋ５６２细胞中ＮＩ　Ｍ和ＮＩ）Ｍ　ｍＡ的表达情况：“：　

过多种途　影响ｒ　Ｊ皿病细胞的增殖与捌ｒ：。　研究发现，　

Ｐ＜０。０１一　Ｋ５６　（１＿绀和Ｋ５６２　ｗｔ组比较；Ｉ｛：（’ＣＫ　８法榆测ＡＫ　ｒ　

（）（、Ｉ／ＡＭＩ　３细胞【Ｉ】天然携带的ＮＰＭ　ｍＡ能够　ｊ　ＡＫＴ相互结　

处理后备纰Ｋ５６２细ｌ胞的体外增殖能力；　：Ｐ、【）．０１．　ｊ　Ｋ５６２　ｃｌ＿＿　

合．井町能参‘　ｌＨ控细胞的增嫡　。奉研究进・步探讨外源　

ＡＫＴⅣ绀手¨Ｋｊ６２　Ｗ１｛ＡＫＴ　ｎ组比较　

性的ＮＰＭ　ｍＡ　ＡＫＴ的相互作Ｈｊ．观察外源一　ＮＰＭ　ｒｎＡ对　

图３　过表达　Ｉ　Ｍ　ｍＡ联合ＡＫＴ　Ｉ＼对Ｋ５６２细胞体外　

ＡＫＴ的、Ｉ　细胞定位的影响．进一步榆测外泺　ＮＰＭ　ｍＡ与　

增殖的影响　

ＡＫＴ埘ｒ１　Ｉ衄卉寸细胞增殖的意义。　

２．３　外源性ＮＩ　Ｍ　ｍＡ与ＡＫＴ刈’　Ｊ叭痫卸１胞增　的意义　

采川１　Ｃｏ—ＩＩ　愉测ＮＰＭ　ｍＡ　ｊ　ＡＫ－ｒ的结合ｆ１　刖，结果显　

图３Ａ中结　，ｊｊ，Ｋ５６２　ｍＡ组和Ｋ５６２　ｗｔ　ｌｊｌ　Ｋ５６２　ｃｌ纽相　

示，Ｋ５６２　ｍＡ　相对分ｆ质＿｝Ｉ＝｝３２×１　０。　附近榆测到了ＮＰＭ　

比ＮＰＭ表达城Ｊ　ｆｔ．仪Ｋ５６２　ｍ人绀表达　Ｉ　Ｍ　ｎ１Ａ。ＣＣＫ　８　ｍＡ的货ｒＪ条带，说明ＮＰＭ　ｎ１Ａ能　ＡＫＴ纳合。ＦＡＩ　ＩＮＩ　

法检测转染　Ｋ５（￣２细胞　同时『开Ｊ的牛长ｌｌｆ１线变化情况。结　等ｌ＿。　将突变的ＮＩ　Ｍ转染到ＮＩＨ３Ｔ３细胞发脱，突变的ＮＰＭ　

果显示，７２　ｈ　Ｋ５６２　ｍＡ组相对于Ｋ５６２　ｃｌ组和Ｋ５６２　ｍＡ　

蛋ｈ主要聚集　胞质【｛１。本研究荧光染色　显示，ＮＰＭ　

细胞体外增吼能力｝ＪＩＪ显增　（Ｐ　０．０１），　３Ａ。观察ＡＷｌ、　

ｍＡ主要　【｝１分　于胞质．此结果与ＦＡ１　ＩＮＩ等　研究一致。　

１４８　

重庆医学２０１８年１月第４７卷第２期　

ｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ　ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃ　ｉｎ—　

ｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＮＰＭ　ｌｅｕｋｅｍｉｃ　ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ　

而ＡＫＴ弥散分布于细胞中，当共同转染ＮＰＭ　ｍＡ和ＡＫＴ到　

ＨＥＫ２９３Ｔ细胞后，ＡＫＴ的定位发生改变，由弥散分布转移至　

细胞胞质。此结果说明，ＮＰＭ发生突变后，突变的ＮＰＭ蛋白　

可能携带ＡＫＴ发生了转移并最终改变了ＡＫＴ的亚细胞　

定位。　

ｉｎ　ＡＭＬ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ＮＰＭ１　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００８，　

２２（６）：１２３４—１２４０．　

ｅｏＦＩｈｏｓｍｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　

［６］　

ＬＩ　Ｚ　Ｌ，Ｂ００ＮＥ　Ｄ，ＨＡＮＮ　Ｓ　Ｒ．Ｎｕｃｌ

为了观察外源性ＮＰＭ　ｍＡ与ＡＫＴ对白血病细胞生物学　

ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｗｉｔｈ　ｃ－Ｍｙｃ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｃ－Ｍｙｃ—－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｈｙｐｅｒｐｒｏ—＿　

效应的影响，本研究选择不携带ＮＰＭ突变基因的・Ｋ５６２细胞　

ｒ　

ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ－Ｉ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　

Ａ，２００８，１０５（４８）：１８７９４—１８７９９．　

　ｔａｒｇｅｔｓ　ｆｏｒ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　

Ｅ７３　

ＰＡＮＤＵＲＡＮＧＡＮ　Ａ　Ｋ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ

作为研究载体，通过慢病毒转染使Ｋ５６２细胞表达ＮＰＭ　ｍＡ　

蛋白。ＣＣＫ一８法检测转染后Ｋ５６２细胞的体外增殖能力，结果　

发现Ｋ５６２　ｍＡ组细胞相对于Ｋ５６２　ｃｌ组和Ｋ５６２　ｗｔ组细胞体　

外增殖能力明显增强，此结果在本课题组以往的研究中亦有阐　

ｏｆ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ：ａ　ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ　ａｎｄ　

ｗｎｔ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ￣．Ａｓｉａｎ　Ｐａｃ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｅｖ，２０１３，１４（４）：　

２２０１—２２０５．　

述［ｉ　。ＡＫＴ　ＩＶ可抑制ＡＫＴ的磷酸化激活。本研究中，采用　

低剂量ＡＫＴⅣ处理４８　ｈ后，Ｋ５６２　ｗｔ组和Ｋ５６２　ｃｌ组体外增　

　ａ１．Ｑｕａｎｔｉｔａ—　

［８］　

ＢＡＣＨＥＲ　Ｕ，ＢＡＤＢＡＲＡＮ　Ａ，ＦＥＨＳＥ　Ｂ，ｅｔ

ｔｉｖｅ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　ＮＰＭ１　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｖａｌｉｄ　ｍｉｎｉ—　

ｍａｌ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ｓｔｅｍ　

殖能力被明显抑制，Ｋ５６２　ｍＡ组细胞仍能维持生长，提示　

ＮＰＭ　ｍＡ能通过ＡＫＴ调控Ｋ５６２细胞的体外恶性增殖。　

综上所述，本研究证实外源性的ＮＰＭ　ｍＡ能够与ＡＫＴ　

结合并改变ＡＫＴ的亚细胞定位，且ＮＰＭ　ｍＡ能通过ＡＫＴ调　

ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２００９，３７（１）：１３５一　

】４２．　

控Ｋ５６２细胞的体外恶性增殖。进一步研究将继续探讨胞质　

ＮＰＭ　ｍＡ对ＡＫＴ活性的调控方式及对ＡＫＴ下游信号分子　

的影响，而ＮＰＭ　ｍＡ对胞质中其他蛋白活性的影响亦是值得　

研究的方向。深入探讨ＮＰＭ突变蛋白在白血病发生、发展中　

的机制，将为阐明白血病的致病机制提供新的理论依据。　

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（收稿日期：２０１７—０６—１８修回日期：２０１７－０８—２６）