2024年3月5日发(作者：)

基于高通量测序的东海带鱼肠道菌群结构分析

油九菊;柳敏海;殷小龙;李伟业;傅荣兵;徐志进

【摘 要】以东海带鱼为研究对象,利用高通量测序技术,分析了其肠道菌群结构特征.测序结果共获得36 129条有效序列,聚类到245个OUTs,有效序列中有4条序列(0.01％)无法进行物种分类,其余分属于16个细菌门,共77个科、127个属.在门的水平上,相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria,52.30％),其次为厚壁菌门(Firmicutes,30.66％);在属的水平上,以弧菌科(Vibrionaceae,49.38％)的发光杆菌属(Photobacterium,47.90％)、梭菌科(Clostridiaceae_1,25.40％)的分节丝状菌(Candidatus_ Arthromitus,17.04％)为主.OTU稀释曲线逐渐趋于平缓,且覆盖率Good's Coverage指数为100％,表明样品测序深度足够大,OUT数量接近实际情况.

【期刊名称】《福建水产》

【年(卷),期】2018(040)006

【总页数】7页(P434-440)

【关键词】高通量测序;东海带鱼;肠道;菌群结构

【作 者】油九菊;柳敏海;殷小龙;李伟业;傅荣兵;徐志进

【作者单位】浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000

【正文语种】中 文

【中图分类】S931

带鱼(Trichiurus haumela)是我国重要海洋经济鱼类之一，主要分布于西太平洋和印度洋，在中国沿海海域均有分布。东海带鱼是东海区海洋渔业中产量最高的主要经济鱼种，也是东海“四大海产”中唯一还能形成较大渔汛的传统捕捞对象，在东海渔业中占据举足轻重的地位。东海带鱼有春汛和冬汛之分，春季向北作生殖洄游，产卵时则洄游至浅海水域，带鱼产卵期很长，一般以4—6月为主，其次是9—11月。2017年7月，本单位率先在室内成功开展带鱼人工驯养，填补了国内空白，在带鱼运输、保活、驯养等方面积累了宝贵的原创性经验。

鱼类肠道微生物是鱼体的重要组成部分，微生物、宿主及宿主所处的生态环境之间形成相互依赖、相互制约、又相对稳定的微生态系统，宿主为微生物提供了栖息环境，而微生物对宿主的发育、营养、免疫和生理健康等方面都起着非常重要的作用。目前关于带鱼的研究报道，主要集中在资源调查、种群生物学、养殖技术等方面[1-5]，尚未见有关带鱼肠道菌群的研究。自然界中很大一部分细菌是不能通过实验室培养而得到其纯分离物，传统培养法存在着较大的局限性，而传统分子生物学方法(如16S rDNA克隆文库、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳等)又存在通量低的缺陷。但16S rRNA高通量测序技术可以对微生物环境中群落进行精确定量，具有通量高、错误率和成本低等特征[6-7]，已广泛应用于水体、土壤、动物等不同环境下微生物群落结构的研究[8-9]。本研究利用16S rRNA高通量测序技术，初步分析了野生东海带鱼肠道菌群结构特征，为深入了解东海带鱼的摄食特征、营养状况等提供参考，也为东海带鱼种质资源的保护和合理开发提供科学依据，以及为带鱼人工养殖技术研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品于2017年5月初，采自舟山市六横岛台门海区，该海区潮流比较平缓，风浪适中，水深在6～9 m，海区底质以泥沙为主，盐度为23.0～27.5，溶解氧为6.5～8.2 mg/L。

1.2 样品采集

现场随机捕获野生东海带鱼50尾，平均全长31.5 cm，平均体重20.8 g，平均肛长12.4 cm。挑选其中活力较好、体表完整无擦伤、剖检内脏无病灶的5尾带鱼，用75%浓度酒精棉球擦拭体表，无菌条件下取出整条肠道，再用75%酒精棉球擦拭肠道外壁，灭菌手术剪剪开肠道，解剖刀刮取各肠道内容物，并混合为一个样品后，置于50 mL灭菌离心管中，灭菌生理盐水冲洗，清洗液与内容物一并保存于-80℃。

1.3 肠道菌群总DNA的提取

按照Power Fecal DNA Isolation kit(MOBIO，USA)试剂盒说明书，提取肠道样品菌群总基因组DNA。利用超微量核酸蛋白测定仪Merinton SMA4000 测定各DNA浓度及纯度，1.2%琼脂糖凝胶电泳检验核酸完整性。

1.4 PCR扩增及Illumina Miseq 测序

以样品菌群总DNA为模板，采用引物343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′对微生物16S rRNA的V3～V4区进行PCR扩增。PCR扩增体系：10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Free)5 μL，25 mmol/L

MgCl2+ 4 μL，dNTP 4 μL，正、反向引物各 1 μL，DNA模板 2 μL，Ex Taq

0.25 μL，超纯水补足50 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测后，利用 Cylcle-Pure试剂

盒(Omega，USA)进行PCR产物的纯化及回收。纯化产物送至欧易生物医学科技有限公司(上海)进行Illumina Miseq高通量测序及分析。

1.5 数据处理及分析

对原始数据进行过滤处理，得到优化序列(Clean tags)，去除嵌合体后得到有效序列(Valid tags)，然后直接进行可操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)聚类分析。OTU分类为人为定义的分类单元，是在系统发生学或者群体遗传学研究中，为了便于分析，人为给某一分类单元(品系、属、种、分组等)设置的同一标志[10]。对有效序列按照97%的相似度进行OTU分类。基于OTU聚类分析结果，评估样本群落测序深度；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

2 结果

2.1 肠道菌群样品总基因组DNA质量检测

利用基因组DNA提取试剂盒，获取了带鱼肠道菌群总基因组DNA，1.2%凝胶电泳结果如图1所示，电泳条带较清晰；经超微量核酸蛋白测定仪测定，DNA样品浓度为103.85 ng/μL，A260/A280为1.94，A260/A230为2.15，表明所获得样品总基因组DNA浓度较高，纯度、完整性较好。

注：M为DNA Marker；A、B为肠道菌群样品。

Notes：M was 2 000 bp DNA ladder；A and B were intestinal flora

samples.

2.2 样品测序质量分析

对Illumina 测序(MiSeq)得到的序列进行预处理，去除低质量的碱基序列以及模糊碱基序列，共得到41 150条细菌序列，进一步去除嵌合体后得到36 129条有效序列(87.79%)，有效序列长度主要分布在401～450 bp之间，平均序列长度

430 bp。以97%的序列相似度进行OTU聚类，共获得245个OTUs。由图2可知，在本试验的测序深度下，样品的稀释曲线趋于平缓，即随测序条数增加，获得的OTU数量变化不大，肠道样品序列覆盖率Good’s coverage指数为100%，说明本试验测序深度足够大，足以覆盖样品的大多数微生物，测序的数据量合理。

2.3 带鱼肠道菌群分类组成

2.3.1 门分类水平上的菌群组成

基于97%的相似度进行OTU聚类分析，统计肠道样品包含的OTU种类以及每个OTU中含有序列的比例。并且对每个OTU挑选出代表序列，同时将所有代表序列与Greengenes数据库[11]比对，通过RDP classifier[12]Naive Bayesian分类算法对代表序列进行分类注释。在245个OTUs、36 129条有效序列中有4条序列无法进行物种分类(0.01%)，其余244个OUTs分属于16个细菌门。如图3所示，东海带鱼肠道菌群中相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria，52.30%)，其次为厚壁菌门(Firmicutes，30.66%)，此外拟杆菌门(Bacteroidetes，8.43%)、蓝藻门(Cyanobacteria，3.30%)、梭杆菌门(Fusobacteria，1.68%)等也占有一定比例。

2.3.2 其它分类水平上的菌群组成

从纲、科、属的水平上看，东海带鱼肠道菌群主要分属于29个纲、77个科、127个属。在纲的水平上，以γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria，51.11%)和梭菌纲 (Clostridia，28.56%)为主；在科水平上，优势菌主要是弧菌科(Vibrionaceae，49.38%)，其次是梭菌科(Clostridiaceae_1，25.40%)；在属的水平上，发光杆菌属(Photobacterium，47.90%)和分节丝状菌(Candidatus_Arthromitus，17.04%)为主要的属。OTU优势度最高的10个纲、科和属见表1。

表1 东海带鱼肠道菌群优势度最高的10个纲、科和属Tab.1 The first ten

classes，families and genera of bacterial communities in intestinal flora of

Trichiurus haumela序号No.菌种(纲)Strain species(class)相对丰度/%Relative

abundance菌种(科)Strain species(family)相对丰度/%Relative abundance菌种(属)Strain species(genus)相对丰度/%Relative abundance1γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)51.11弧菌科Vibrionaceae49.38发光杆菌属Photobacterium47.902梭菌纲 Clostridia28.56梭菌科Clostridiaceae_125.40分节丝状菌Candidatus_Arthromitus17.043拟杆菌纲Bacteroidia7.65紫单胞菌科Porphyromonadaceae3.65梭菌科未分类Clostridiaceae_1,Other5.144芽孢杆菌纲Bacilli1.84梭杆菌科Fusobacteriaceae1.56梭状芽胞杆菌1

Ostridium_sensu_stricto_13.215梭杆菌纲Fusobacteriia1.68肠杆菌科Enterobacteriaceae1.48紫单胞菌科Parabacteroides属2.216未知菌群Other1.21肠球菌科Enterococcaceae1.41梭杆菌属Fusobacterium1.567柔膜菌纲Mollicutes0.87拟杆菌目_S24_7_group1.27肠球菌属Enterococcus1.418放线菌纲Actinobacteria0.72拟杆菌科Bacteroidaceae1.26拟杆菌属Acteroides1.269鞘脂杆菌纲Sphingobacteriia0.60普雷沃氏菌科Prevotellaceae1.26未知菌群Other1.2110δ-变形菌纲Deltaproteobacteria0.33未知菌群Other1.21卟啉菌属Porphyromonas0.96

3 讨论

对鱼类肠道菌群组成的研究，国内外已有相关报道[13-23]。本文以现场捕捞的东海浅海区生活的鲜活带鱼为试验对象，对东海带鱼肠道微生物环境进行初步分析，希望为人工驯养、饵料选择、健康状态评估等提供理论依据。据报道，肠道菌群结构及数量与鱼的种类、栖息水域、饵料状况和生理状况等相关[15-16]。周金敏等[15]利用培养法分别从养殖黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)肠道及水体中分离出

9类和11类细菌；尹雪梅等[17]通过PCR-DGGE技术分析了养殖河鲀肠道细菌组成，获得了29个OTUs，且有8个OTUs相似度低于98%；王程程等[16]也利用PCR-DGGE技术对福建三沙湾养殖大黄鱼肠道菌群进行研究，仅获得了8个OTUs，虽然克服了对培养方法的依赖，但存在测序量低的缺陷。本文采用Illumina高通量测序技术分析了野生东海带鱼肠道菌群结构，测序获得有效序列36 129条，基于97%相似度原则，聚类归为245个OTUs；OTU稀释曲线序列覆盖率达100%，表明本测序结果可客观真实地反映出野生东海带鱼肠道菌群结构组成。

以往对鱼类肠道菌群的研究表明，变形菌门和厚壁菌门是最普遍和共同存在于鱼类肠道中的细菌类群，且拟杆菌门在不同的鱼类肠道中以较低丰度存在[19]。本研究发现，东海带鱼肠道菌群在门的水平上，以变形菌门为最主要的优势菌，其次是厚壁菌门，拟杆菌门占有一定比例(8.46%)，门水平上的菌群组成与大多数鱼类一致。本研究中还发现肠道中有梭杆菌门、未知菌群等的存在，但丰度较低(均<3.30%)。在纲的水平上，γ-变形菌纲为优势菌，其次为梭菌纲，这与Roeselers等[19]关于模式生物斑马鱼肠道微生物的研究结果一致。福建养殖大黄鱼肠道内容物菌群以梭菌纲为优势菌，γ-变形菌纲位列其次，东海带鱼则与之相反，这与宿主居住的水体环境、季节变化、饵料类型、个体发育期、生理状态等因素可能存在一定的关联。后期将在不同个体发育时期、不同海区等东海带鱼肠道细菌的群落结构组成、胃容物、营养及生理状况等方面展开深入探索，以不断丰富野生东海带鱼生物学基础信息，为野生东海带鱼种质资源保护及后期合理开发等提供理论依据。

诸多研究表明，淡水鱼和海水鱼肠道中优势菌分别与水体环境中的优势菌相类似，在科、属的水平上，淡水鱼类肠道菌群多以气单胞菌属及肠杆菌科等为优势菌群[15，21]，而海水鱼肠道多以喜盐的弧菌属(Vibrio)为主[22-23]。野生东海带鱼肠道菌群以弧菌科的发光杆菌属和梭菌科的分节丝状菌为主要的属，均属于肠道菌属，

但与海水鱼肠道菌群研究相关报道结果不一致，这可能是由东海带鱼的索饵场饵料状态、水质状况、自身生理状况等各种因素所致，也可能是试验鱼对离水取样操作产生了强烈的应激性反应的结果，具体原因还需深入探索。宛立等[24]、杨莺莺等[25]采用培养法鉴定出南美白对虾肠道中的优势菌为发光杆菌属、弧菌属和气单胞菌属，而在鱼类中未见发光细菌属为优势菌的报道。本研究还发现，带鱼肠道中分节丝状菌(SFB)占据17.04%的比例，动物模型研究证明SFB直接参与宿主肠道免疫系统的成熟[26]，这对野生带鱼在自然海区状态下，肠道免疫机制的建立及免疫系统功能的发挥等都具重要意义。

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