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健康管理2020年10月 第10期

基于TCGA数据库分析鉴定肾透明细胞癌预后生物标志物

宋　琪　潍坊医学院　山东潍坊　261053

摘要：目的 使用生物信息学分析，构建竞争内源性RNA网（ceRNA）和临床预后模型，探讨肾透明细胞癌潜在的生物标志物及其预后

价值。方法 从TCGA数据库下载肾透明细胞癌和癌旁组织的转录组和临床数据，利用R软件筛选出差异表达的lncRNA、mRNA、miRNA，

然后利用miRcode、TargetScan、miRTarBase 和miRDB 等公共数据库建立lncRNA-miRNA及miRNA-mRNA的关系对，对网络中的三种RNA进

行总体生存分析并进行COX回归分析构建预后模型。结果 差异分析显示肾透明细胞癌与癌旁组织相比，存在显著差异的lncRNAs1517个、

mRNAs2331个、miRNAs173个(|logFoldChange| < 2,P<0.05)，基于此构建了包含125个DElncRNA、52个DEmRNA以及25个DEmiRNA的ceRNA

网络，检测到其中29个lncRNAs、18个mRNAs、7个miRNAs与总生存期显著相关（P <0.01）。分别构建网络中三种RNA的预后模型，显示

出包含3个lncRNAs、9个mRNAs、6个miRNAs的模型具有较高可信度。lncRNA(WTI- AS/AC016773.1/LINC00460),mRNA(has-mir-144/ has-

mir-223/ has-mir-21),miRNA(NOD2/IL11/COL4A4/RRM2)在生存分析及预后模型中均显示出其重要意义。结论 本研究通过构建肾透明细胞癌

相关的ceRNA网络及其预后模型，探讨了新的肾透明细胞癌预后相关的可能潜在生物标记物，可能作为肾透明细胞癌的治疗靶点。

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常见的泌尿系肿

瘤，肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）约其占

70-80%

。ccRCC发病机制目前尚不清楚，可能与吸烟、遗传等因

素相关。其对放、化疗不敏感，局部手术治疗是早期肾癌的主要治

疗方法。晚期肾癌的靶向药物选择因为缺乏明确的靶点而非常局

限。

因此鉴别肾透明细胞的预后标志物，为寻找其治疗靶点提供

理论依据尤为重要。

1材料与方法

1.1 数据下载与预处理 从TCGA数据库筛选并下载肾透明细胞

癌患者的转录组分析数据和临床信息（截止时间为2019年9月）。

利用R软件的TCGABiolinks包对三种RNA表达谱进行整合和提取。

使Ensembl在线数据库对基因进行注释并换为基因名称。

1.2 筛选差异表达的lncRNA、mRNA、miRNA用edgeR软件包

对下载的三种RNA进行差异表达分析（log2FoldChange（FC）|> 2，

P<0.05）。使用R软件的ggplots2包绘制了三种RNA的火山图。

1.3 构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络 利用miRcode在

线工具预测DElncRNAs靶向miRNA，建立lncRNA-miRNA相互

作用对。STARBASE v2.0数据库对DEmiRNAs序列进行解码。用

miRDB、miRTarBase、TargetScan3个数据库预测DEmiRNAs的靶基

因，建立miRNA-mRNA相互作用对，并利用Venny在线网站将预测

的DEmiRNA的靶基因与本研究中DEmRNA取交集。基于lncRNA-

miRNA和miRNA-mRNA关系对，建立lncRNA-miRNA-mRNA

ceRNA网络。

1.4 生存分析 R软件的survival包对ceRNA网络中差异表达3种

RNA进行了Kaplan-Meier（K-M）独立生存分析（P＜0.01）。

1.5 构建预后模型及独立预后分析 利用R软件的survival包、

glmnet包、survminer包分别对三种RNA进行单因素Cox比例风险回

归分析（P＜0.05）、LASSO回归、多因素Cox回归分析。R软件中

survival 包用于绘制K-M 生存曲线。使用R软件中的ROC软件包估

计三种RNA 模型在ROC曲线下的面积（AUC）。

2结果

2.1 TCGA数据集的预处理及差异分析 从611例标本中收集了

lncRNAs 和mRNAs的表达数据（539例肿瘤标本、72例正常标本）；

miRNA表达样本616个（肿瘤样本545个，正常样本71个）。差异分

析显示1517个差异表达的lncRNA(1068个上调，449个下调)；2331

个mRNA差异表达（1569个上调、762个下调）；173个差异表达的

miRNAs（106个上调，67个下调）。

2.2 构建ceRNA网络 使用在线网站miRcode和STARBASE v2.0

数据库筛选出lncRNA-miRNA对，包含125个DElncRNA和25个

DEmiRNA。运用miRDB，miTarBase 和TargetScan在线数据库发现

1040个靶基因，获得与本研究相关的差异表达的DEmRNA52个。并

基于DElncRNAs-DEmiRNAs 靶标对和DEmiRNAs-DEmRNAs 靶标

[2]

[1]

对构建ceRNA网络。

2.3 CeRNA网络中差异基因的生存分析 基于R软件survival包（P

<0.01），125个lncRNAs中共鉴定出29个与肾透明细胞癌的预后密

切相关，其中高表达的CHL1-AS1、COL18A1-AS1、LINC00443、

LINC00472、SLC25A5-AS1、TCL6与高生存率相关，可作为抑

癌因子；但是高表达的AC004832.1、AC011510.1、AC016773.1、

AC105020.1、AL356356.1、AP001029.2、C20orf203、FAM13A-

AS1、HOTTIP、IL20RB-AS1、LATS2-AS1、LINC00299、

LINC00460、LINC00524、MIAT、MLIP-AS1、MTUS2-AS1、

NALCN-AS1、PVT1、TRIM36-IT1、UCA1、VCAN-AS1、WT1-

AS与较低的生存率相关，提示这些lncRNAs可能为致癌因子。52个

mRNAs中共发现18个mRNA与预后相关，其中高表达的CCND1、

COL4A4、ERMP1、ESRRG、PRELID2、SLC22A6预后较好，而

高表达的E2F1、E2F2、GOLGA8A、GOLGA8B、IL11、NOD2、

POLQ、RRM2、SLC12A5、SPI1、TFAP2C、TGFBI预后不良。25

个miRNAs中分析得到7个miRNAs与预后相关，其中高表达的hsa-

mir-144、hsa-mir-204、hsa-mir-215与高生存率相关，高表达的

hsa-mir-21、hsa-mir-155、hsa-mir-221、hsa-mir-223与不良预后

相关。

2.4 构建预后模型及独立预后分析 对ceRNA网络中的3种RNA

单变量Cox比例风险回归分析，得到42个lncRNAs、26个mRNAs和9

个miRNA（P<0.05）；将结果进行LASSO回归分析，并进行2000倍随

机交叉验证，分别得到3个lncRNAs、13个mRNAs和9个miRNA；将

LASSO回归分析结果进一步提交多因素Cox比例风险回归分析，得

到3个lncRNAs（WT1-AS、AC016773.1、LINC00460），6个miRNA

（hsa-mir-184、hsa-mir-301b、hsa-mir-144、hsa-mir-223、hsa-

mir-200a、hsa-mir-21）和9个mRNA （PCDHA12、NOD2、BTG2、

PRELID2、IL11、COL4A4、GOLGA8B、GOLGA8B、RRM2、

COL5A3）。根据这3个风险预后模型，计算患者风险评分，根据中

位风险评分，将患者分为高低风险组。K-M分析显示，在三种模

型中，高风险组和低风险组的OS存在显着差异（图1 A-C）。计算

lncRNA、mRNA 和miRNA的5年曲线下的面积（AUC）值，分别为

0.696、0.733、0.742，说明模型具有较高可信度。

3讨论

竞争内源性RNA (Competing endogenous RNAs， ceRNAs)是一种

通过竞争共享的miRNAs在转录后水平上相互调控的转录产物。研

究表明，ceRNAs是转录后调控的关键，广泛的参与多种癌症的发

生、发展[3、4]。但在肾透明细胞癌相关的研究中涉及ceRNA的较

少。本研究中我们基于TCGA数据库，应用R软件等相关技术构建

了肾透明细胞癌的ceRNA调控网络并构建了预后模型。最终筛选

出3个lncRNAs、6个miRNA和9个mRNA。在3个lncRNA中，曾有研

究表明，WT1-AS在NSCLC中过表达通过下调UCA1抑制NSCLC细

健康管理2020年10月 第10期

胞的侵袭和迁移

[5]

； WT1-AS在肾透明细胞癌可以作为独立的预后

因子

，这与我们的研究结果相一致。在肾癌的研究中，有研究表

明LINC00460参与了ceRNA的构建，这也印证了我们的研究。较少

有研究表明AC016773.1与癌症的关系。miRNA中，hsa-mir-21的

过表达被认为是肾细胞癌患者临床病理特征和不良预后的重要预

测因子，在肾癌中起重要作用

[7]

；有研究表明hsa-mir-144与ccRCC

患者的OS呈正相关

。hsa-mir-184是一种具有抗凋亡作用的致癌

miRNA，其在乳腺癌中的表达也上调

；hsa-mir-301b、hsa-mir-

200a与肾母细胞瘤、乳腺癌

[9]

等相关，目前未查阅到与肾透明细胞

癌相关的研究；hsa-miR-223可能协同下调多种肿瘤抑制基因的表

达，从而降低肾透明细胞癌患者的生存

。9个DEmRNA中，NOD2

在多项研究中被证实与恶性肿瘤相关，如结直肠癌、肺癌

[11]

。一

项对照实验研究表明BTG2过表达抑制人肾癌细胞的生长、迁移和

侵袭

。曾有研究表明COL5A3在肾透明细胞癌中起关键作用，

这也证实了我们的研究结果。有研究指出，RRM2与肝癌、肺腺癌

的发生、发展有关，并通过激活EGFR/AKT促进细胞化疗耐药

。

IL-11高表达是ccRCC患者预后不良的独立预测因子

。几乎没有

研究提供直接的证据表明GOLGA8B、CDHA12和COL4A4与癌症有

关，有待进一步的研究。

综上所述，通过构建肾透明细胞癌ceRNA网络和预后模型，

lncRNA（WT1-AS、LINC00460、AC016773.1），miRNA（hsa-

mir-21、hsa-mir-144、hsa-mir-223），mRNA（NOD2、PRELID2、

IL11、COL4A4、GOLGA8B、RRM2）在生存分析和预后模型中均

显示出对于肾透明细胞癌的重要意义，为指导乳腺癌的治疗和深入

研究提供了新的诊断和预后生物标志物。

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