2024年4月16日发(作者：)

南京农业大学学报

2021,44(1)

：

103-110

Journal

of

Nanjing

Agricultural

University

http

:

/

/

nauxb

.njau.

edu

.

cn

DO1

：

10.7685/jnau.202004037

李婷

,

朱文姣

，

陈敏

，

等

.

茄子

SmNTF3

基因的克隆及其表达模式分析

[J].

南京农业大学学报

,2021,44(1)

：

103-110.

L1

Ting

,ZHL

W'enjiao,CHEN

Min

,

et

al.

Cloning

and

expression

pattern

analysis

of

SmNTF3

gene

in

eggplant

[J].

Journal

of

Nanjing

Agricultural

Lniversity

,2021,44(1)

：

103-110.

茄子

SmNTF3

基因的克隆及其表达模式分析

李婷,朱文姣

，

陈敏

，

杨清

”

(

南京农业大学生命科学学院

，

江苏南京

210095)

摘要

：

［

目的

］

本文旨在克隆茄子

(

Solanum

melongena

L.)

促分裂原活化蛋白激酶

(

MAPK)

基因

SmNTF

3

,

阐明其在盐和干旱

胁迫处理下的表达特性

。

［

方法

］

以茄子

’

苏崎

1

号

’

为试验材料

，

克隆

SmNTF3

的全长序列

，

对其基因结构和序列同源性进

行分析

，

通过烟草叶片瞬时表达系统进行

SmNTF3

蛋白的亚细胞定位

，

采用实时荧光定量

PCR

检测

SmNTF3

基因在不同组

织及盐和干旱胁迫下的表达情况

。

［

结果

］

SmNTF3

基因开放阅读框长度为

1

119

bp

，

编码

1

个含

372

个氨基酸残基的蛋

白。

生物信息学分析表明

，

该蛋白具有保守的

S_TKc

结构域

，

富含

a

-

螺旋和无规则卷曲

。

系统发育分析表明

，

SmNTF3

属

于

MAPK

家族

C

组成员

，

其氨基酸序列具有高度保守性

，

与番茄和马铃薯亲缘关系最近

。

亚细胞定位发现

,SmNTF3

蛋白

在烟草叶片的细胞核和细胞质膜上表达

。

SmNTF3

基因具有组织特异性

，

在茎中表达量最高

。

盐和干旱胁迫能够显著诱导

SmNTF3

基因的上调表达

。

［

结论

］

从茄子中克隆了

1

个

MAPK

家族

C

组成员

SmNTF3

，

该基因受盐和干旱胁迫诱导表达

，

可能参与茄子对盐和干旱胁迫的响应过程

。

关键词

:

茄子

;

SmNTF3

基因

;

克隆

;

亚细胞定位

;

表达分析

中图分类号

:

S641.1

文献标志码

：

A

文章编号

：

1000-2030

(

2021

)

01-0103-08

Cloning

and

expression

pattern

analysis

of

SmNTF3

gene

in

eggplant

L1

Ting,ZHU

Wenjiao,CHEN

Min,YANG

Qing

*

(

College

of

Life

Sciences

,

Nanjing

Agricultural

University

,

Nanjing

210095,

China)

Abstract

:

［

Objectives

］

The

paper

aimed

to

clone

mitogen-activated protein

kinase

(

MAPK

)

gene

SmNTF3

in

eggplant

and

detect

its

expression

patterns

characteristics

under

salt

and

drought

stresses.

［

Methods

］

The

full-length

of

SmNTF3

was

cloned

from

eggplant

'

Suqi

1

The

gene

structure

and

sequence

homology

were

analyzed

by

bioinformatics

methods.

Subcellular

localization

of

SmNTF3

protein

was

performed

with

the

tobacco

leaf

transient

expression

system.

The

expression

patterns

of

SmNTF3

gene

in

different

organs

and

under

salt

and

drought

stresses

were

analyzed

using

real-time

quantitative

PCR

technique.

［

Results

］

The

open

reading

frame

of

the

eggplant

SmNTF3

gene

was

1

119

bp

in

length

,

and

encoded

a

protein

of

372

amino

acid

residues

with a

conserved

S_TKc

domain

and

the

rich

a

-helices

and

irregular

curls.

Phylogenetic

analysis

showed

that

SmNTF3

belonged

to

a

member

of

MAPK

fa^nily

,

and

the

amino

acid

sequence

of

SmNTF3

was

highly

conserved

and

had

the

closest

relationship

with tomato and

potato.

Subcellular

localization

analysis

revealed

that

SmNTF3

protein

was

located

on

the

nucleus

and

plasma

membrane

of

tobacco

leaves.

The

expression

level

of

SmNTF3

was

in

different

tissue-specific

and

high

in

stem

,

and

increased

under

the

salt

and

drought

treatments.

［

Conclusions

］

1n

this

study

,

SmNTF3

,

a

member

of

MAPK

family

C

,

was

cloned

from

eggplant

,

and

was

induced

by

salt

and

drought

stresses.

The

results

indicated

that

it

may

be

involved

in

the

response

of

eggplant

to

salt

and

drought

stresses.

Keywords

:

eggplant

；

SmNTF3

gene

；

cloning

；

subcellular

localization

；

expression

analysis

茄子

(

Solanum

melongena

L.

)

是世界范围内广泛种植的一种农作物

，

含多种维生素和生物碱

,

营养价

值丰富并兼具药用作用

。

我国茄子种质资源丰富

，

栽培普遍

,

但其产量和质量极易受各种不良环境的影

响

［

1

］

。

近年来

，

由于世界水资源的严重短缺以及保护地栽培造成的土壤盐碱化

，

干旱和盐胁迫已成为影

响农作物生长的重要胁迫源

［

2

］

。

因此

，

发掘抗旱

、

耐盐基因对于培育抗盐、

抗旱茄子品种具有重要意义

。

植物面对不利胁迫时会通过多种信号传导途径进行防卫

，

促分裂原活化蛋白激酶

(

MAPK)

级联途径

是真核生物主要存在的信号传导模块

［

3

］

。

在植物中

，

MAPK

通路由

MAPKKK(MAPKK

激酶

)

、

MAPKK

(

MAPK

激酶

)

和

MAPK

组成

，

通过磷酸传递机制将上游受体与下游靶点连接起来

,

参与生长发育

、

程序性

细胞死亡以及各种环境刺激的响应

［

4-5

］

o

已有相关研究报道

YODA

(a

MAPKKK

)

-

MKK4/MKK5-MPK3

/

收稿日期

：

2020-04-20

基金项目

：

国家自然科学基金项目

(

31901582)

；

江苏省自然科学基金项目

(

BK20180519)

；

江苏省高等学校优先级学术发展项目

一一

现代园

艺科学

(

PADH)

作者简介

：

李婷

，

硕士研究生

。

*

通信作者

：

杨清

，

教授

，

研究方向为植物分子与遗传工程

，

E-mail

：

qyang19@

。

104

南

京

农

业

大

学

学

报第

44

卷

MPK6

能够有效调控花序结构

［

6

］

；

MKK9-MPK6

对叶片衰老过程有调节作用

［

7

］

；

GhMEKK14-GhMKK11-

GhMPK31

通路调节棉花的干旱胁迫耐受性等

［

8

］

。

MAPK

位于级联途径的下游

，

催化区域一般由

300

左右的氨基酸残基组成

，

该区域包含

11

个保守亚

结构域

（

I

—

卫

）

和

TXY

双磷酸化位点⑼

。

根据

TXY

基序

，

植物

MAPK

可被分为

4

组

（

A

—

D

）

，

不同的序

列结构参与多种生物学过程

。

研究表明机械损伤

、

干旱

、

低温

、

高盐及外源信号分子等胁迫都会诱导

MAPK

家族基因选择性表达

［

10-12］

；

转

MAPK

基因的植株能够显著增强环境抗逆性

［

13

］

,

表明该家族基因广

泛参与植物的胁迫响应过程

。

目前

,

MAPK

家族已在拟南芥

［

14

］

、

辣椒

［

15

］

、

棉花

［

16

］

、

水稻

［

17

］

等多种高等植物中被鉴定和研究

。

烟草

NTF3

基因已被报道在盐和干旱胁迫诱导下表达水平显著上调

［

18

］

，

但关于茄子

NTF3

基因的研究还未见

报道

。

本研究从茄子'苏崎

1

号

’

中克隆得到

SmNTF3

基因

，

对其系统发育关系

、

亚细胞定位及盐和干旱

胁迫下的表达模式进行分析

，

为进一步研究

SmNTF3

的生物学功能奠定基础

。

1

材料与方法

1.1

植物材料与处理

茄子

‘

苏崎

1

号

’

为江苏普遍种植品种

，

购于江苏省农业科学院

。

将种子

55

C

恒温水浴

15

min

以打

破休眠

，

消毒漂洗

，

平铺于

MS

培养基

，

置于光照

/

黑暗时间为

16

h/8

h

、

昼

/

夜温度为

（

28±1

）

C/

（

25±1

）

C

、

光照强度

200

jimol-m

_2

-s

_1

培养箱中培育

，

发芽后正常光照培养

。

待长出

4~5

片真叶

，

取出幼

苗水培

1

周

，

选取长势健康且一致的幼苗作为试验材料

。

每个试验重复

3

次

。

组织样品取样:取茄子

’

苏崎

1

号

’

植株的主根

、

茎段和幼嫩叶片迅速置于液氮中冷冻保存

，

用于

SmNTF3

基因组织表达模式检测

。

盐胁迫处理

:

将茄子幼苗浸泡在

0

、

50

、

100

、

150

、

200

和

250

mmol-L

-1

的

NaCl

培养液中

12

h,

取叶片进

行基因表达水平检测

;

选择响应最显著的

NaCl

浓度进行不同时间处理

,

分别于

0

、

3

、

6

、

12

、

24

和

48

h

时取

样

，

以去离子水作为对照

。

干旱胁迫处理

:

将茄子幼苗分别浸泡在

0

、

5%

、

10%

,15%

、

20%

和

25%

（

体积分数

）

的

PEG-6000

培养液

中处理

12

h,

取叶片进行基因表达水平检测

;

选择响应最显著的

PEG-6000

水平进行不同时间处理

，

具体

方法同盐胁迫

。

1.2

SmNTF3

基因的克隆

采用

Triozl

法提取茄子总

RNA

,

测定核酸浓度

，

使用

Goldenstar

TM

RT6

cDNA

Synthesis

Kit

（

擎科

）

的两

步法反转录获得

cDNA

。

将烟草

NTF3

（

NtMPK14

）

基因序列在茄子基因组数据库

（

/

）

中进行

BLAST

比

对

，

获得茄子同源序列

Sme2.5_02990.1_g00003.1,

命名为

SmNTF3

。

以茄子叶片

cDNA

为模板进行扩增

，

引物见表

1

。

将

PCR

产物连接至

pMD19-T

载体

,

转化大肠杆菌

，

阳性菌落送上海生工生物工程有限公司

测序

。

表

1

本研究所使用的引物序列

Table

1

Sequences

of

primers

in

this

study

引物名称

Name

of

primer

SmNTF3-F

SmNTF3

-R

引物序列

Sequence

of

primer(5'i3')

ATGGCAACTCCAGTTGAGCCAC

TCACATAACATCTCCCATTCCAGC

引物用途

Lsage

of

primer

编码区扩增

Amplification

of

coding

region

GFP-F

GFP-R

GGACTAGTATGGCAACTCCAGTTGAGCC

CGGGATCCCATAACATCTCCCATTCCAGC

亚细胞定位载体

Subcellular

localization

vector

实时荧光定量

PCR

RT-qPCR

茄子内参基因

Reference

gene

of

eggplant

qPCR-F

qPCR-R

SmEF-1a-F

SmEF-1a-R

AAGCTCATCCGTTGGCCATT

CCCAAGTCCTCGTCTATGTCAAG

CCACACTTCTCATATTGCTGTCA

ACCAGCATCACCATTCTTCAAAA

1.3

生物信息学分析

利用

ORF

finder

(

http

:

//

www.

ncbi.

nih

.

gov/gorf/gorf.

html

)

进行

SmNTF3

基因的开放阅读框预测

，

用

ExPASy

的

ProtParam

程序

(

http

:

//

web

.

expasy.

()

rg/protparam/

)

对蛋白理化性质进行分析

,

用

NetPhos

3.

1

(

http

:

//

.

dtu.

dk/services/NetPhos/

)

进行磷酸化位

点预测

，

通过

SMART

(

http

:

//

smart

.

emblheidel-

第

1

期

李婷

，

等

:

茄子

SmNTF3

基因的克隆及其表达模式分析

105

/)

网站进仃保寸结构域分析

，

用

Predict

Protein(

/)

和

SWISS-MODEL

(https

：

//

swissmodel.

expasy

.

org/

)

进行蛋白二级和三级结构预测

。

SmNTF3

同源序列由

NCBI

网站下载

，

利用

DNAMAN

6.0

软件进行氨基酸序列比对

;

MEGA

7.0

软件用

于构建进化树

，

采用邻接法

(

Neighbor-joining

method)

绘图

‘

bootstrap

设置为

1

000

。

1.4

SmNTF3

-GFP

载体的构建与亚细胞定位

将

SmNTF3

基因序列去除终止密码子

,

设计用于亚细胞定位的特异性引物

(

表

1)

，

扩增目的片段并构

建克隆载体

，

经

Spe

I

和

Bam

H

I

双酶切连接至载体

pCAMBIA1305

，

构成重组质粒

SmNTF3-GFP

。

利用农

杆菌介导法将构建好的融合载体与

Marker

共同转化烟草叶片细胞

，

正常培养

2~3

d

后

，

选择长势良好的

叶片进行制片

，

置于激光共聚焦显微镜下观察

。

1.5

实时荧光定量

PCR

根据

SmNTF3

基因序列设计特异引物

,

以茄子

EF-1a

为内参基因

，

引物序列见表

1

。

RT-qPCR

具体步

骤按照

2XTSINGKE

Master

qPCR

Mix(SYBRGreenI)

(

擎科

)

说明书进行

。

一次平行试验设

3

组重复

。

通过

熔解曲线结果分析引物的可用性

，

相对定量结果以

2

-AA

C

t

计算

。

采用

Excel

2007

和

SPSS

19.0

软件进行数

据统计与分析

。

2

结果与分析

2.1

茄子

SmNTF3

基因的克隆及测序

以

’

苏崎

1

号

’

叶片

cDNA

为模版

，

扩增得到大小约

1

100

bp

的目的片段

(

图

1)o

经测序及

ORF

FINDER

分析

,

SmNTF3

长度

Marker

SmNTF3

bp

2

000

为

1

119

bp,

编码

1

个含有

372

个氨基酸残基的蛋白

，

该序列与茄

子基因组数据库

Sme2.5_02990.1_g00003.1

基因序列完全一致

。

2.2

SmNTF3

蛋白的结构分析

采用

ProtParam

工具对

SmNTF3

蛋白的生化特性进行分析

，

1

000

1

119

bp

结果显示

SmNTF3

蛋白的相对分子质量为

42

699.36,

等电点为

6.32,

总平均亲水系数

(GRAVY)

为

-0.260,

说明它是

1

个亲水

750

500

蛋白

。

利用

NetPhos

网站对

SmNTF3

蛋白序列进行磷酸化位点预

测

。

结果

(

图

2)

显示

:

SmNTF3

蛋白有潜在磷酸化位点

32

个

,

丝

250

100

氨酸

(

Ser)

、

苏氨酸

(

Thr)

和酪氨酸

(

Tyr

)

位点分别为

15

、

9

和

8

个

。

其中

109

、

188

、

256

和

313

位的

Ser,195

位的

Thr

和

197

位的

Tyr

磷酸化概率较高

,

推测是

SmNTF3

激酶的磷酸化位点

。

图

1

SmNTF3

基因的

PCR

扩增产物

Fig.

1

The

PCR

product

of

SmNTF3

gene

对

SmNTF3

蛋白结构域进行分析

，

发现在第

32~319

氨基酸残基处有

1

个丝氨酸

/

苏氨酸激酶催化结

构域

(

S_TKc)

。

S_TKc

是

MAPK

家族的保守结构域

［

19

］

，

提示

SmNTF3

属于茄子

MAPK

家族

。

丝氨酸

Serine

;

------

苏氨酸

Threonine

;

-------

酪氨酸

Tyrosine

；

-------

阈值

Threshold

I

&

p

u

o

l

o

d

U

O

B

E

B

o

q

d

s

o

q

d

序列位置

Sequence

position

图

2

SmNTF3

磷酸化位点预测

Fig.

2

Predicted

phosphorylation

或

tes

in

SmNTF3

106

南京农业大学学报

第

44

卷

蛋白二级结构分析结果

（

图

3

）

显示

,SmNTF3

蛋白中无规则卷曲占

44.

35%,

a

-

螺旋占

35.

75%,0

-

折

叠占

19.89%,

并具有

17

个蛋白结合位点

。

进一步对其三级结构进行分析

（

图

4

）

，

结果显示

SmNTF3

折叠

交错呈复杂的三级结构

，

在

C

端多为

a

-

螺旋

，

而

N

端

0

-

折叠较多

。

21

42

63

84

105

1

..............................................

|

126

147

|

168

189

210

231

252

273

294

315

336

.............................................

‘

I

‘

「

_

369

I

I

1

IT

17

I

H

T

T

■

III

■

■

■■

■■

I

■

■

I

■

■

S

）

IE

■

Y

I

IT

i

■

iiiiiii

■

■

ii

■

in

ill

bi

ii

11

iiiiaiui

mi

ii

图

3

SmNTF3

蛋白二级结构预测

Fig.

3

The

predicted

secondary

structure

of

SmNTF3

protein

2.3

SmNTF3

同源性比对与进化树分析

利用

NCB1

数据库检索

SmNTF3

同源序列

,

对茄科及拟南

芥中的

NTF3

同源序列进行比对

，

结果

（

图

5

）

显示

，

整体序列

相似度高达

87.06%,6

条氨基酸序列均具有

MAPK

家族的

11

个保守亚结构域

，

第训和第

W

亚域之间存在

TEY

激活位点

。

SmNTF3

与番茄

SlMPK9

（

C

组

MAPK

）

及马铃薯

StNTF3

的同

源性最高

（

98.39%

）

,

与辣椒

、

烟草和拟南芥的序列同源性分别

为

96.77%

、

96.24%

和

84.95%

。

以上结果表明

SmNTF3

属于

MAPK

家族

C

组成员

，

茄科

NTF3

序列保守性较高

。

利用

MEGA

7

对

14

个物种的

NTF3

蛋白序列构建系统进

图

4

SmNTF3

三级结构模型

Fig.

4

Tertiary

structure

model

of

SmNTF3

8

o

8

o

8

o

8

o

8

o

8

o

化树

，

结果

（

图

6

）

显示茄科的

5

种植物聚为同一分支

，

茄子

SmNTF3

S1MPK9

StNTF3

CaNTF3

NtNTF3

AtMPKl

Consensus

SmNTF3

S1MPK9

StNTF3

CaNTF3

NtNTF3

AtMPKl

Consensus

SmNTF3

S1MPK9

StNTF3

CaNTF3

NtNTF3

AtMPKl

Consensus

LGSQREE

SmNTF3

NQ]

LKLI

平

H

ilgsqree

NQ]

LKLI

S1MPK9

”

血

GSQREE

NQ]

iiai

StNTF3

CaNTF3

NQ]

JOI

NILGSQREI

NtNTF3

NQ]

1KLI

NILGSQREI

NILGSQREI

AtMPKl

NQ]

Consensus

nqlkli

嘲

ESS

疋

MAT

GKHY

GKHY

GKHY

-?j

GKHY

T?|

GKHY

N

耳

GKHY

■EIDTIGl

PIKPIGRGAYG

辽创诙册

RET

HEKVAIKKI

j

EIDTKY

PIKPIGRGAYG

jllMBMSfflfllRES

NEKVAIKKI

-EIDTKY

PIKPIGRGAYC

NEKVAIKKI

H

阳舸炯

RET

NEKVAIKKI

iEIDTKY

PIKPIGRGAYC

打

EKVAHKKT

iEIDTiq

PIKPIGRGAYG

'EIDTK^

PIKPIGRGAYC

!VgMaSMMfll3DT

HEKVAIKKI

--F

2

z

z

■J

2

-

SaMaaMoiRET

DALRTLREI

DALRTLREL

DALRTLREL

DALRTLREL

DALR

TLREI

DALRTLRE1

.RHLRHENVIALKDVMMPI

：

.RHLRHENVI^LKDVMMPI]

.RHLRHENVULKDVMMPD

■RHLRHENVIALKDVMMPI]

■RHLRHENVIALKDVMMPI]

.RHLRHENVIALKDVMMPI]

IV

|SFKDVYLVYKLMDTD

LHQ

：

[|

；

FKDVYLVYELMDTnLHQ"

iCQYFLFQLLRGLKYHHSANILHRDLK

SFKDVYLVYEDMDTDLHQI

SFKEVYLVYEL^DTDLHQI

SFKDVYLVYELMDTDEHQI

SFKDVYLVYELMDTDLHCI

iCGYFLFGLLRGLKYMHS7NILHRDLK

iCQYFLFQLLRGLK^

gHSANILHRDLK

iCQYFLFQLLRGLld

iCQYFLFQLLRGLK^

0HSANILHRDLK

B

hsanilhrdlk

HQYFLFQLLRGLKYgHSANTLHRDLK

60

60

60

60

60

60

EYVVTRWYRAFELLLCCDNYGTSIEVWSVGCIFAELLGRb

EY^mRWRAPELLLCCDNYGTSIDVWSVGCIFAELLGRF

24

24

24

24

24

24

o

o

o

o

o

o

SRLYE

MLVFEPSKRISV

EALQHPYN

SRLYI

SAH

[LAIELLQg

MLVFEPSKRISV

EALQEPYM

smi

MLVFDPSKRISV

MLVFEPSKRISV

EALQHPYN

SRLYi

S

ahslaiell

^

SRIYI

S

ah

I

lazellq

MLVFEPSKRISV

EALQHPYL-1

圈耐轉盹

i

、

i

MLVFDPSKRISV

EALQHPY?

S

a

H5LAIDLL<^

sr

E

ye

32

o

3

2

o

3

2

o

3

2

o

3

2

o

3

2

o

ealqhpym

SA.-.TAGMGLV

EA=TA-WEEV

SmNTF3

S1MPK9

StNTF3

CaNTF3

NtNTF3

AtMPKl

Consensus

二

.TMMEEV

r.--APME.-.V

371

371

371

371

371

371

图

5

茄子与其他物种的

NTF3

氨基酸序列比对

Fig

・

5

Alignment

of

amino

acid

sequence

of

NTF3

protein

in

eggplant

and

other

species

Sm

：

茄子

Solanum

melongena

；

Sl

：

番茄

Solanum

lycopersicum

(

NP_001233761.1

)

；

St

：

马铃薯

Solanum

tuberosum

(

XP_006341972.

1)

；

Ca

：

辣椒

Capsicum

annuum(XP_016568515.1)

；

Nt

：

烟草

Nicotiana

tabacum

(

Q405

17.1)

;At

：

拟南芥

Arabidopsis

thaliana

(

NP

172492.1).

下同

。The

same

as

follows.

I

—卫

分别表示

MAPK

家族

11

个保守亚结构域

，

红色方框标注出

TXY

双磷酸化位点

。

I

-卫

indicate

the

11

conserved

subdo

­

mains

of

the

MAPK

family

,

and

the

red

box

indicates

the

TXY

double

phosphorylation

site.

第

1

期

李婷

,

等

:

茄子

SmNTF3

基因的克隆及其表达模式分析

—

SH1NTF3

■jr

StNTF3

(XP_006341972.1)

107

SmNTF3

与来自番茄和马铃薯的同源序列亲缘关系最

近

。

除茄科外

SmNTF3

与大花牵牛及油橄榄等进化关

系相对较近

,

而与拟南芥

、

西葫芦

、

狭叶羽扇豆等亲缘关

系较远

。

2.4

SmNTF3

亚细胞定位

在

SubLoc

v1.0

database

数据库中对

SmNTF3

进行

分析

，

预测结果显示其定位于细胞核和细胞质膜中

。

将

SmNTF3

-GFP

与

Marker

载体转化烟草叶片进行瞬时表

达

,

采用激光共聚焦显微镜进行观察

，

结果

（

图

7

）

显示

,

H

-----

0.01

L

S1MPK9

(NP_001233761.1)

--------

CaNTF3

(XP_0

16568515.1)

-

NtNTF3

(Q40517.1)

InNTF3

(XP_019153326.1)

------------

OeNTF3

(XP_022852976.1)

--------------------

HaNTF3

(XP_02

1983730.1)

I

—

—

RcNTF3

(XP_02416547Xl)

------

FvNTF3

(XP_004291845.1)

—

CsNTF3

(XP_006473550.1)

—

------------LaNTF3

(XP_0

19459013.1)

--------------

AtMPKl

(NP_1

72492.1)

-----------------

CqNTF3

(XP_02

1759925.1)

在细胞核和细胞质膜上均能看到

SmNTF3-GFP

融合蛋

白绿色荧光

，

且与

Marker

红色荧光蛋白完全重叠后呈

黄色

，

说明

SmNTF3

可能定位于细胞核和细胞质膜

。

2

・

5

SmNTF3

基因组织表达分析

图

6

不同物种

NTF3

氨基酸序列的系统发育分析

Fig.

6

Phylogenetic

analysis

of

amino

acid

sequences

of

NTF3

from

different

species

In

：

大花牵牛

Ipomoea

nil

；

Oe

:

油橄榄

Olea

europaea

var.

sylvestris

；

Ha

:

向日葵

Helianthus

annuus

；

Rc

:

月

季

Rosa

chinensis

；

Fv

：

野草莓

Fragaria

vesca

subsp.

vesca

；

Cs

:

甜橙

Citrus

sinensis

；

La

：

狭叶羽扇豆

Lupinus

angustifolius

；

Cq

:

西葫芦

Cucurbita

pepo.

对

SmNTF3

基因在茄子发育过程中的组织表达模

式进行分析

,

结果

（

图

8

）

显示

:

SmNTF3

在茎中表达量

最高

，

显著高于根和叶

，

在根和叶中表达量无明显差异

,

说明

SmNTF3

在茄子中呈现组织特异性表达

。

SmNTF3

・

GFF

Marker

Merged

GFP

:

核

Marker

(Nuclear

marker)

GFP

：

质膜

Marker

(Plasma

membrane

marker)

图

7

SmNTF3

亚细胞定位

Fig.

7

Subcellular

localization

of

SmNTF3

Bar=

20

ixm.

2.6

SmNTF3

在盐胁迫下的表达分析

从图

9

可知

：

SmNTF3

的表达随

NaCl

处理

浓度的增加呈先上升后下降的趋势

，

在

100

mmol

-1

NaCl

浓度胁迫下表达量最大

,

约为对

u

.2

s

s

a

l

d

x

Q

A

B

E

ls

a

2.0

1.5

**

1.0

0.5

照的

2

倍

（

图

9-A

）

。

选择

100

mmol-L

-1

NaCl

进

行不同时间处理试验

，

结果

（

图

9-B

）

显示

，

盐胁

迫处理

3

h,

SmNTF3

表达量显著上调

,

而后逐步

0

艮

Root

茎

Stem

组织

Tissue

叶

Leaf

下降

，

胁迫处理

48

h,

SmNTF3

的表达量与对照

图

8

SmNTF3

的组织表达分析

Fig.

8

Expression

profiles

of

SmNTF3

in

eggplant

*

P<0.05

,

*

*

P<0.01.

The

same

as

follows.

差异不显著

。

以上结果说明

SmNTF3

基因响应

盐胁迫

。

108

南

京

农

业

大

学

学

报第

44

卷

1S

A

2

I

A.

不同浓度的

NaCl

处理

12

h

时

SmNTF3

基因表达量变化

Changes

of SmNTF3

gene

expression

level

after

treatment

with

different

oonoentrations

of

NaCl

for

12

h

；

B.

100

mmol*L

-1

NaCl

处理不同时间后

SmNTF3

基因表达量变化

Changes

of

SmNTF3

gene

expression

level

after

treatment

with

100

mmol

•

L-1

NaCl

at

different

time.

2.7

SmNTF3

在干旱胁迫下的表达分析

从图

10

可知

:

PEG-6000

胁迫处理显著诱导

SmNTF3

基因的表达

，

在

PEG-6000

含量为

5%

、

10%

和

15%

时

SmNTF3

表达量持续上调

，

在

15%

PEG-6000

时表达量最高

，

是对照的

6.5

倍

（

图

10-A

）

。

选择

15%

PEG-6000

进行时间处理试验

，

结果

（

图

10-B

）

显示

:

随处理时间的延长

,

SmNTF3

表达量呈先上升后下降

趋势

，

在

12

h

达到最高

。

这些结果说明

SmNTF3

基因响应干旱胁迫

。

*

澈

臺

Fig.

10

Expression

level

analysis

of

SmNTF3

gene

under

PEG-6000

simulated

drought

stress

A.

不同含量的

PEG-6000

处理

12

h

时

SmNTF3

基因表达量变化

Changes

of

SmNTF3

gene

expression

level

after

treatment

with

different

contents

of

PEG-6000

for

12

h

；

B.

15%

PEG-6000

处理不同时间后

SmNTF3

基因表达量变化

Changes

of

SmNTF3

gene

expression

level

after

treatment

with

15%

PEG-6000

at

different time.

u

.2

SSUJdxg

O

A

9

E

H

图

9

盐胁迫下

SmNTF3

基因的表达量分析

Fig.

9

Analysis

of

SmNTF3

expression

level

under

salt

stress

15

A

3

u

.2

SSQJdxoOAgzIOM

PEG-6000

含量

/%

PEG-6000

content

t/h

图

10

PEG-6000

模拟干旱胁迫下

SmNTF3

基因的表达量分析

3

讨论

MAPK

是一类丝氨酸

/

苏氨酸

（

Ser/Thr

）

蛋白激酶

，

在真核生物中具有高度的进化保守性

［5

］

。

NTF3

基

因最早作为

MAPK

同源体在烟草中被克隆

,

基因鉴定发现其属于

MAPK

家族

C

组成员

［

18

,

20

］

。

本研究从茄

子

'

苏崎

1

号

’

中克隆得到

SmNTF3

基因

，

其编码蛋白具有保守的

S_TKc

结构域

。

S_TKc

结构域包含

TXY

双磷酸化位点

，

这是上游基因进行磷酸化的部位

。

通过磷酸化位点预测

，

我们寻找到

SmNTF3

蛋白可能发

生磷酸化的氨基酸残基位置

，

这对茄子

MAPK

级联途径的研究具有重要意义

。

氨基酸序列分析表明

SmNTF3

包含

MAPK

基因的保守结构域和

TEY

基序

，

与

MAPK

家族

C

组成员序列高度同源

，

认为

SmNTF3

属于

C

组

。

系统发育分析显示

SmNTF3

与来自番茄及马铃薯的同源序列亲缘关系最近

，

同源性明显高于

其他物种

，

说明茄科

NTF3

同源序列高度保守

。

此外

，

SmNTF3

与拟南芥

、

西葫芦等同源性也较高

，

说明

NTF3

在不同物种中均具有保守性

，

这在其他物种

MAPK

基因的研究中有相似结论

［

21

］

。

MAPK

作为将信号分子从细胞表面传递到细胞核的重要因子

,

主要在细胞核上表达

，

部分

MAPK

也

可能在细胞质或细胞膜等部位磷酸化特定的蛋白⑷

。

已有研究报道番茄

SlMPK7

定位于细胞核和细胞

膜

［

22

］

；

玉米

ZmMPK3-1

主要定位于细胞膜和细胞核

［

23

］

；

玉米

ZmMPK5

定位于细胞核

、

细胞质和细胞

膜

［

24

］

。

本研究通过

SmNTF3

在烟草叶片中的瞬时表达发现其定位于细胞核和细胞质膜

，

与上述研究结果

一致

，

也与其功能相符

。

第

1

期

李婷

，

等

:

茄子

SmNTF3

基因的克隆及其表达模式分析

109

在植物

MAPK

的研究中

，

尽管

C

组研究相对较少

,

但已有的文献能够表明不同物种的

MAPK

家族

C

组成员广泛参与植物生长发育与外界刺激响应过程

。

目前研究较充分的是拟南芥中的

4

个

C

组

MAPK

基因

：

AtMPK1

、

AtMPK2

、

AtMPK7

和

AtMPK14

。

机械损伤和茉莉酸

(

JA)

诱导拟南芥

AtMPK1

和

AtMPK2

的

表达

[25]

；

AtMPK1/2

参与的级联途径能够有效调控拟南芥对盐胁迫的耐受性以及植物的衰老过程

[26-27]

；

AtMPK7

和

AtMPK14

在植物响应病原菌的防卫过程中起关键作用

[28]

。

此外

，

豌豆

PsMPK2

对机械损伤

、

脱落酸

(

ABA)

和过氧化氢等信号分子的诱导产生响应

[29]

；

番茄

SlMPK8

和

SlMPK9

在热胁迫下表达量显

著上调

[30]

；

烟草

NtNTF3

在

JA

和干旱处理时上调表达

[18]

。

在本研究中

，

SmNTF3

基因在盐和

PEG-6000

干旱处理下响应显著

，

说明

SmNTF3

可能参与植物对盐及干旱胁迫的应答过程

，

这些结果为进一步研究该

基因的生物学功能提供理论依据

。

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,

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salt

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Identification

of

new

members

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in

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diverse

conserved

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func-tional

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mitogen-

110

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农

业

大

学

学

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is

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责任编辑

:

刘怡辰