2024年4月13日发(作者：)
CTAB法提取植物总DNA
【实验目的】
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改
良植物总DNA抽提方法。
【实验原理】
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤
其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原
剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程
中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum
bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子
解细胞型表面活性剂，能溶膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋液白质变性，并使抽提分相，因核酸(DNA、RNA)
水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水
乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
【仪器、材料、试剂】
(一) 仪器
1．高速离心机
2．烘箱
3．冰箱
4．水浴锅
5. 高压灭菌锅
（二）材料
1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)
2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris）
3．乙二胺四乙酸（EDTA）
4. 氯化钠
5．2-巯基乙醇
6. 无水乙醇
7. 氯仿
8. 异戊醇
（三）试剂
1. CTAB抽提缓冲溶液: 250ml
配制方法：称取CTAB 20g，放入1 L的烧杯， NaCl 81.82g、1 moll Tris-HCl
( PH8.0) 100ml、0.5 mol/l EDTA( PH8.0) 40ml 定容至1L摇匀后，转到准备好的瓶中，
贴上标签，高压灭菌后，降至室温, 冷却后加入4ml的2-巯基乙醇（0.2-1% 使用前加入），
4℃保存。
2. 氯仿:异戊醇=24：1
3. 灭菌水
【实验步骤】
(一) DNA的提取
1. 2%CTAB抽提缓冲液和0.4%的巯基乙醇在65℃水浴中预热；
2. 取少量叶片置于研钵中加液氮，用小杵磨至粉状；此步要快，防止DNA氧化。
3. 加入2ml的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；
4. 置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔5 min轻轻摇动，45 min后取出；
5. 冷却2 min后，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，振荡2~3 min，使两者混合均匀；
6. 10000 rpm离心10 min，移液器轻轻地吸取上清液至另一新的灭菌离心管中；
7. 加入2/3倍体积的异丙醇（-20°C预冷），将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇
与水层充分混合室温放置15min至能见到DNA絮状物；
8. 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出
9. 加入800 μl 75--80%的乙醇（均可以），洗涤DNA；
10. 10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
11. 加入50 μl 双蒸水，使DNA溶解；
12. 置于-20℃保存、备用。
【注意事项】
1. 叶片磨得越细越好。
2. 注意移液器的正确使用。
3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活
性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降
解。
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