2024年4月11日发(作者：)

化学发光法EMSA检测试剂盒

Chemiluminescent EMSA Detection Kit

说明书修订日期：

说明书修订日期

：2015.12.01

货号：KGS133

保存温度：-20℃

For Research Use Only

一、产品简介

本产品是一种通过Streptavidin-HRP及ECL检测试剂来实现化学发光检测Biotin标记的EMSA探针

的检测试剂盒。同时本试剂盒也提供EMSA检测所需的结合缓冲液和上样缓冲液，及一些关键的相关试剂，

可以实现非同位素的EMSA检测。

本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，

这样比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。

本试剂盒采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。

EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，

可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。

本试剂盒可以用于20个蛋白和探针的结合反应，并足够检测至少2块有生物素标记EMSA探针的膜。

二、组份列表

产品组份

EMSA/Gel-Shift

结合缓冲液

(5X)

EMSA/Gel-Shift

上样缓冲液

(

无色，

10X)

EMSA/Gel-Shift

上样缓冲液

(

蓝色，

10X)

ECL Reagent A

ECL Reagent B

Streptavidin-HRP Conjugate

封闭液

洗涤液

(5X)

检测平衡液

规格（

规格

（50T）

100µl

100µl

100µl

28ml

28ml

50µl

190ml

125ml

125ml

保存温度

-20℃

-20℃

-20℃

4℃

4℃

-20℃

4℃

4℃

4℃

注：如果长期不用，整个试剂盒可-20℃保存，-20℃可以保存更长时间。

三、注意事项

1.

2.

3.

四、使用说明

1.

探针的标记

探针的标记：

：

可以直接选购凯基生物素标记EMSA探针，或其他合适的生物素标记EMSA探针。

需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。

如果需要使用更多的封闭液或洗涤液，可另外单独订购凯基封闭液或洗涤液。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

胶的配制：

2. EMSA

胶的配制：

A. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装

置)，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，

可以选择可灌制较大EMSA胶模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。

B. 按照如下配方配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝胶：(注：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

TBE buffer(10X)

重蒸水

39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)

80%

甘油

10%

过硫酸铵

(ammonium persulfate)

TEMED

1.0ml

16.2ml

2ml

625

μ

l

150

μ

l

10

μ

l

C. 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入后立即混匀，并马上加入到制胶的模具

中。避免产生气泡，加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

3. EMSA

结合反应

结合反应：

：

A. 如下设置EMSA结合反应

阴性对照反应

Nuclease-Free Water

EMSA/Gel-Shift

结合缓冲液

(5X)

细胞核蛋白或纯化的转录因子

标记好的探针

总体积

探针冷竞争反应

7

μ

l

2

μ

l

0

μ

l

1

μ

l

10

μ

l

4

μ

l

2

μ

l

2

μ

l

1

μ

l

1

μ

l

10

μ

l

4

μ

l

2

μ

l

2

μ

l

1

μ

l

1

μ

l

10

μ

l

5

μ

l

2

μ

l

2

μ

l

1

μ

l

10

μ

l

4

μ

l

2

μ

l

2

μ

l

Nuclease-Free Water

EMSA/Gel-Shift

结合缓冲液

(5X)

细胞核蛋白或纯化的转录因子

未标记的探针

标记好的探针

总体积

Super-shift反应

Nuclease-Free Water

EMSA/Gel-Shift

结合缓冲液

(5X)

细胞核蛋白或纯化的转录因子

目的蛋白特异抗体

标记好的探针

总体积

样品反应

Nuclease-Free Water

EMSA/Gel-Shift

结合缓冲液

(5X)

细胞核蛋白或纯化的转录因子

标记好的探针

总体积

突变探针的冷竞争反应

Nuclease-Free Water

EMSA/Gel-Shift

结合缓冲液

(5X)

细胞核蛋白或纯化的转录因子

未标记的突变探针

标记好的探针

总体积

1

μ

l

1

μ

l

10

μ

l

B. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从

而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室

温(20-25℃)放置20分钟。

C. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有时溴酚蓝会影响蛋白和

DNA结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感

觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可观察到蓝色即可。

4.

电泳

电泳：

：

A. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，

可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。

B. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的

EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。

C. 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至

EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。

转膜：

5.

转膜：

A. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自

始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。

B. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。

C. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。

D. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。

E. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。

F. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA

胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，

用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较

厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰

浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。

G. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立

即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。

6. DNA

交联

交联：

：

A. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。如果没有紫

外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内

的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。

B. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入

下一步检测。

如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A

的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。

7.

化学发光法检测生物素标记的探针

化学发光法检测生物素标记的探针：

：

A. 37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。

注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确

保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。

B. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢

摇动15分钟。

C. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。

D. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。

在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

E. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。

F. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。

G. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。

H. 重复步骤G三次(共洗涤四次，每次洗涤5分钟)。

I. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。

J. 取5ml ECL Reagent A和5ml ECL Reagent B混匀，配制ECL Reagent工作液。注意：ECL Reagent

工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。

K. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或

保鲜膜上。

L. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml ECL Reagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室

温放置2-3分钟。

M. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于

压片暗盒(也称片夹)内。

N. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以

直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。