2024年4月11日发(作者：)

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丕ｊ篷一Ｅｔ 期：羔垒啦三Ｊ生 一

——————————————————————————～、 ／四 一 苏州大学

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非涉密论文囱 论文作者签名： 三墨ｉ娩 Ｅｔ 期：丛！Ｌ丕：蝗 导师签名： 隘

至塾 日期：趔ｆ厶主２丝．ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９介导的脑微』ｆｌＬ管内皮细

胞紧密连接蛋白的下调在ＣＮＳＬ发病机制中的作用 中文摘要 ＭＭＰ－２和ＭＭ

Ｐ母介导的脑微血管内皮细胞紧密连接 蛋白的下调在ＣＮＳＬ发病机制中的作用

中文摘要 目的和意义 中枢神经系统是白血病髓外浸润的常见部位，发生中枢神经

系统白血病（ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｌｅｕｋｅｍｉａ，

ＣＮＳＬ）的患者总体生存时间短，预后差，然而目前对ＣＮＳＬ的发病机制却知

之甚少。白血病细胞存在于造血系统中，随血液循环到达全身各部位，同实体瘤的

转移过程相似，其在转移过程中必须克服某些生理屏障。血脑屏障（Ｂｌｏｏｄ－

ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）是位于血液和脑组织之间的一个选择性通透

的细胞系统，严格控制血脑两侧的物质转运。研究表明基质金属蛋白酶（ｍａｔｒ

ｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰ）－２和ＭＭＰ－９与白血病

细胞的侵袭能力有关，在某些中枢神经系统疾病中，ＭＭＰ－２’和ＭＭＰ－９能够

通过破坏ＢＢＢ的脑微血管内皮细胞（ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅ

ｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．ＢＭＶＥＣｓ）之间的紧密连接而增加ＢＢＢ

的通透性。已知某些白血病细胞高表达ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－－９，且其表达高低

与其预后密切相关，但在白血病细胞浸润中枢神经系统过程中是否能通过分泌的Ｍ

ＭＰ－２和ＭＭＰ－０作用于ＢＢＢ并增加其通透性，从而获得其对中枢神经系统

的侵犯目前尚不清楚。本课题通过建立体外ＢＢＢ模型和ＣＮＳＬ动物模型，研究

ＣＮＳＬ中白血病细胞分泌的ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９对ＢＭＶＥＣｓ紧密连接和

ＢＢＢ的影响，探索ＣＮＳＬ的发病机制。方法 第一部分实时定量ＰＣＲ检测ＳＨ

Ｉ—ｌ、ＨＬ－６０和Ｕ９３７白血病细胞ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９ｍＲＮＡ表达

水平；明胶酶谱法检测ＳＨＩ—ｌ、ＨＬ－６０和Ｕ９３７白血病细胞培养上清中

ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９的表达；体外穿膜实验观察各自血病细胞的体外侵袭能力。

观察ＭＭＰ抑制剂ＧＭ６００１对各白血病细胞分泌ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９的变

化及对白血病细胞侵袭能力的影响。用ＲＮＡ干扰技术沉默ＳＨＩ—ｌ细胞ＭＭＰ

－２和ＭＭＰ－－９基因的表达， Ｔ中文摘要 ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９介导的脑

微血管内皮细胞紧密连接蛋白的下调在ＣＮＳＬ发病机制中的作用并观察沉默ＭＭ

Ｐ－２和ＭＭＰ－９后对ＳＨＩ－１细胞分泌ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９的影响及对

ＳＨＩ—ｌ细胞侵袭能力的影响。将原代人ＢＭＶＥＣｓ接种于Ｔｒａｎｓｗｅｌ

ｌ小室系统中建立体外ＢＢＢ模型并鉴定，将ＧＭ６００１处理后的ＨＬ－６０、

ＳＨＩ－１和Ｕ９３７细胞或小干扰ＲＮＡ懒帅（ｉＲＮＡ）沉默ＭＭＰ－２或Ｍ

ＭＰ－９后的Ｓｉｌｌ—ｌ细胞于ＢＢＢ模型中与ＢＭＶＥＣｓ共培养２４ｈ，倒

置相差显微镜观察共培养后ＢＭＶＥＣｓ的形态变化；激光共聚焦显微镜观察ＢＭ

ＶＥＣｓ的紧密连接蛋白ＺＯ一１、ｃｌａｕｄｉｎ－５和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表

达变化；计算白血病细胞的穿膜率或侵袭率反映白血病细胞对ＢＢＢ通透性的影响。

第二部分 对４４只ＢＡＬＢ／ｃ‘裸鼠进行切脾，环磷酰胺腹腔注射及全身亚致死

剂量辐照等预处理后，将其随机分为３组，空白对照组：共８只，经尾静脉注射０．２

ｍｌ ＰＢＳ；ＳＨＩ－１组：共３０只，尾静脉接种１．２ｘ１０７个Ｓｉｌｌ一

１细胞；ＧＭ６００１组：共８只，尾静脉接种１．２×１ｄ７个Ｓｉｌｌ一１细

胞后从ｄ１天开始予５ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＧＭ６００１腹腔注射，直至２１天。观察

各组裸鼠的饮食、活动性、体重等一般情况的变化及瘫痪、失明等ＣＮＳＬ的临床

表现，同时每周处死２只ＳＨＩ一１组裸鼠和１只空白对照组裸鼠观察最早能检测

到人Ｍｕ似Ｆ６融合基因的最早时间。所有裸鼠在层流柜中无菌饲养观察至接种Ｓ

ＨＩ－１细胞后第６０天。在裸鼠濒死时将其处死，取脑组织、骨髓及其他各脏器，

应用ＲＴ－ＰＣＲ检测各脏器中人ＭＬＬ／ＡＦ６基因的转录，骨髓涂片、组织病

理学等方法检测裸鼠脑组织、骨髓及其他各脏器中ＳＨＩ－１细胞浸润生长情况。

应用ＲＴ－ＰＣＲ检测脑组织中人ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９基因的转录；原位明胶

酶谱法检测脑组织中ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９的表达；采用免疫荧光染色激光扫描

共聚焦显微镜及Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ方法检测ＢＭＶＥＣｓ紧密连接蛋白Ｚ

Ｏ一１、ｃｌａｕｄｉｎ－５和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表达，组织免疫荧光双染法检

测ＢＢＢ的破坏情况。结果 第一部分 ①在ＳＨＩ－１、Ｕ９３７和ＨＬ－６０白

血病细胞中，Ｓｉｌｌ一１表达较高转录水平的ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９及酶活性，

且侵袭能力强于其它细胞系（Ｐ＜Ｏ．０１）。②与白血病细胞ＨＬ－６０、ＳＩ

ｔｌ一１和Ｕ９３７共培养２４ ｈ后，致密融合的ＢＭＶＥＣｓ之间出现间隙，细

胞呈单个生长；紧密连接蛋白ＺＯ－１、ｃｌａｕｄｉｎ－５和ｏｃｃｌｕｄｉｎ

的表达明显下调；各白血病细胞均不同程度的穿过体外ＢＢＢ屏障，其中细胞系Ｓ

ｉｌｌ—ｌ对ＢＭＶＥＣｓ的形态改变及对三种紧密连接蛋白的下调最为明显，对

ＢＢＢ的破坏最强（Ｐ＜０．０１）。ＧＭ６００１明 ＨＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９

介导的脑微ｍ管内皮细胞紧密连接蛋白的下调在ＣＮＳＬ发病机制中的作用 中文

摘要显抑制了各白血病细胞分泌的ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９，使ＢＭＶＥＣｓ的形

态有所恢复；同时上调了ＺＯ—ｌ、ｃｌａｕｄｉｎ－５和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表

达，降低了ＢＢＢ的通透性。③用ｓｉＲＮＡ分别沉默ＳＨＩ－１细胞的ＭＭＰ－

２和ＭＭＰ－９基因后，ＳＨＩ一１细胞分泌的ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９明显减少，

且细胞的侵袭能力较干扰前明显下降；ＳＨＩ一１细胞对ＢＢＢ的破坏程度较前明

显降低，同时ＺＯ一１、ｃｌａｕｄｉｎ－５和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表达较ＭＭＰ

－２和ＭＭＰ－９基因沉默前明显上调。第二部分 对照组裸鼠（除外每周处死的）

生存期大于６０天以上而无死亡。存活的２０只ＳＨＩ－１组裸鼠中有１１只在（３