2024年3月20日发(作者：)

生物工程　

食品研究与开发　

Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　

２０１１年５月　

第３２卷第５期　

ｉ４３＝＝Ｉ　

土壤中明串珠菌的筛选与鉴定　

金红星，胡炎华。成文玉。杨希寅　

（河北工业大学化工学院，天津３００１３０）　

摘要：从土壤中分离筛选明串珠茵，通过对其生理生化特性的研究并基于１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列的系统发育树分析确定其　

分类地位。结果该菌株为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、精氨酸和七叶苷水解阴性、发酵葡萄糖产酸产气、不生成葡聚　

糖。可发酵利用果糖、蔗糖、蜜二糖、麦芽糖、Ｌ一阿拉伯糖、Ｄ一木糖、棉籽糖、核糖、水杨苷，延迟利用半乳糖和甘露糖，　

微弱利用纤维二糖、乳糖、海藻糖和Ｌ一鼠李糖，不可利用甘露醇；系统发育树表明该菌株属于假肠膜明串珠茵，命名　

为ｋｉｍｓｈｉ００５，在ＧｅｎＢａｎｋ上的登录号为ＧＵ１３０１９５。　

关键词：土壤；明串珠茵；特性；鉴定；系统发育树　

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｎｔｉ行ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｆｒｏｍ　Ｓｏｉｌ　

ＪＩＮ　Ｈｏｎｇ－ｘｉｎｇ，ＨＵ　Ｙａｎ－ｈｕａ，ＣＨＥＮＧ　Ｗｅｎ－ｙｕ，ＹＡＮＧ　Ｘｉ—ｙｉｎ　

（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１３０，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｏｉｌ．Ｔｈｅ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｓｔａｔｕｓ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　

ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｅｓｔ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ，ｉｔ　ｉｓ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　

ｗａｓ　Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｃａｔａｌａｓｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ，ａｒｇｉｎｉｎｅ　ａｎｄ　ａｅｓｃｕｌｉｎ　ｕｎｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　Ｃ０２　ｇａｓ　ａｎｄ　

１ａｃｔａｔｅ　ｆｒｏｍ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｂｕｔ　ｄｏｎ＇ｔ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｄｅｘｔｒａｎ　ｆｒｏｍ　ｓｕｃｒｏｓｅ．Ｆｒｕｃｔｏｓｅ，ｓｕｃｒｏｓｅ，ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ，ｍａｌｔｏｓｅ，Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ，　

Ｄ－ｘｙｌｏｓｅ，ｍｅｌｉｔｆｉｏｓｅ，ｒｉｂｏｓｅ　ａｎｄ　ｓａｌｉｃｉｎ　ｃａｎ　ｂｅ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ，ｂｕｔ　ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ａｎｄ　ｍａｎｎｏｓｅ　ｔｕｒｎｅｄ　ｔｏ　ｔｅ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｉｎ　ｕｓｅ　

ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ，ｌａｃｔｏｓｅ，ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ　Ｌ－ｒｈａｍｎｏｓｅｃａｎ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｗｅａｋｌｙ　ｕｓｅｄ　ｂｕｔ　ｍａｎｎｉｔｏｌ　

ｃａｎ　ｎｏｔ　ｂｅ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｓｔｒａｉｎ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｃｌａｓｓｉｉｆｅｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　ｏｆ　Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　

ｐｓｅｕｚｔｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ｂｙ　ｋｉｍｓｈｉ００５．Ｔｈｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｋｉｍｓｈｉ００５　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｗａｓ　

ＧＵ１３０１９５．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｏｉｌ；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　

明串珠菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）是一类进行异型发酵的革　很好；（４）它能分泌特异性胞外蛋白（如葡聚糖蔗糖　

兰氏阳性、耐氧的乳酸细菌，是韩国泡菜的发酵过程　

酶）且没有降解蛋白活性［２ｊ。明串珠菌具有产生葡聚糖、　

中起主要作用的微生物【１］。在乳制品的生产中明串珠　甘露醇和双乙酰、水解　一半乳糖苷、代谢生成Ｋ族维　

菌应用广泛，近年来内地对它的研究开始活跃。在食　生素等多种生理功效，在改善食品风味和功能性食品　

品生物技术中明串珠菌是表达不同蛋白很好的候选　

（包括益生制品）的生产方面应用广泛［３］。明串珠菌的　

菌，是因为它具有如下特性：（１）它是美国ＦＤＡ认可　生存环境较为宽泛，主要存在于植物表面和根部以及　

的安全菌株（ＧＲＡＳ，ｇｅｎｅｒａｌｌｙ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ａｓ　ｓａｆｅ）；（２）它　蔬菜发酵过程中　－２］。　

不产生内毒素；（３）它在好氧还是厌氧条件下都生长　

１材料与方法　

作者简介：金红星（１９６８一），男（朝鲜），讲师，博士，研究方向：微生　

１．１材料　

物学。　

土样采自河北省沽源县金莲山区林下，白菜为天　

ｔｈｅｐａｒａｄｉｇｍｏｆ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２５（１）　：［Ｊ］．中国农村小康科技，２００６（９）：５２—５４　

５８—６０　

［６】徐丽艳，纪明山．植物次生代谢物的类型及其对植物自身的作用　收稿１３期：２０１０—１１－２５　

－＝＝，１４４　金红星，等：土壤中明串珠茵的筛选与鉴定　生物工程　

津市售，培养基包括：ＭＲＳ培养基、精氨酸水解培养　圆形菌落，黏稠、表面光滑、有光泽、边缘整齐无褶皱、　

直径约在１　ｍｉｌｌ左右。经染色并镜检观察，得到的菌株　

为革兰氏阳性，细胞均为球形或椭球形，以成对或短链　

存在，极少数排列成相对较长的链，不形成荚膜，如图１　

所示。　

基、葡聚糖生成培养基、ＰＹ基础培养基、糖类利用实验　

培养基嗍。　．　

１．２土壤中明串珠菌的富集　

将适量白菜洗净切块后加入３％的ＮａＣ１溶液研　

磨并蒸汽灭菌。取适量土壤用１０　ｍＬ无菌水混匀，然后　

在５０　ｍＬ白菜盐水溶液中加人土壤溶液１　ｍＬ，室温厌　

氧条件下静置培养７　ｄ。　

１－３土壤中明串珠菌的分离筛选　

取富集培养的液体５０　均匀涂布于ＭＲＳ固体　

培养基上，置于３０℃恒温培养箱中培养２４　ｈ～３６　ｈ，挑　

取灰白色圆形单菌落在ＭＲＳ固体培养基上划线，纯化　

２次。经万古霉素（３０￣ｇ／ｍＬ）抗性鉴定后，进行革兰氏　

染色、镜检，选取革兰氏阳性具有典型明串珠菌细胞形　

态的菌株接人ＭＲＳ液体培养基，用１Ｏ％二甲基亚砜　

于一７Ｏ　ｑＣ低温保存以待进一步研究　，菌株代号为ＧＹ。　

１＿４菌株的鉴定　

图１菌株细胞形态　

Ｆｉｇ．１　Ｃｅｌｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ（Ｇｒａｍ　ｓｔａｉｎ）　

２．２生理生化特性　

通过测定明串珠菌在１℃和３７℃的生长情况、运　

动性、葡萄糖产酸产气情况、精氨酸和七叶苷水解情　

况、葡聚糖产生情况以及耐盐性和乙醇耐受性，检测　

菌株的鉴定方法参照《伯杰细菌鉴定手册》第８　

版问和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》　，分ＳＵ￣ｍＪ定明　

串珠菌在１℃和３７℃的生长情况、运动性、葡萄糖产　

酸产气情况、精氨酸和七叶苷水解情况、耐盐性、乙醇　

耐受性以及其他糖类利用情况，通过形态特征和生理　

生化特性初步确定菌株的分类地位。　

１．５　１６Ｓ　ｒＤＮＡ测序　

明串珠菌的生长特性。产酸产气实验和碳水化合物利　

用实验表明该菌可以利用葡萄糖及一些其它碳水化　

合物产生乳酸，实验结果分别见表１和表２。　

表１菌株生长特性　

Ｔａｂｌｅ　１　Ｇｒｏｗｔｈ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　

实验项目　

革兰氏染色　

３７℃生长　

ｌ　ｑＣ生长　

结果　

明串珠菌的染色体ＤＮＡ提取参照Ｋｉｍ等使用的　

方法［８１。以染色体ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增菌株的　

１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列。ＰＣＲ的正向引物为５　一　

ＡＧＡＧｒＩＴＩＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ一３　，反向引物为５　一　

ＧＧｃＴＡＣＣＴＴＧ　ｒｒＩ’ＡｃＧＡＣ１＿ＴＩ－３　ＯＰＣＲ反应体系为５０　Ｉ　，　

运动性　

过氧化氢酶　

精氨酸水解　

葡萄糖产酸　

葡萄糖产气　

葡聚糖生成　

其中ｂｕｆｆｅｒ（含ＭｇＣ１２）５　ＩｘＬ，２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　２　，模　

板２　Ｌ，１０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ的引物各２　Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶　

３　Ｌ，去离子水３４　ｔｘＬ。ＰＣＲ扩增条件为预变性９５℃　

１０　ｍｉｎ；９５　ｏＣ　６０　Ｓ－，５３℃６０　ｓ、７２℃９０　Ｓ，３０个循环；最　

七叶苷水解　

万古霉索／（３０￣ｇ／ｍＬ）　

５％乙醇　

１０％乙醇　

后７２℃延伸１０　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物送北京六和华大基因科　

技股份有限公司进行测序。　

３％氯化钠　

６．５％氯化钠　

注：“＋”表示阳性；“一”表示阴性；…Ｗ’表示弱阳性。　

１．６系统发育树分析　

从ＧｅｎＢａｎｋ中提取明串珠菌属内的代表菌株的　

１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列，用ＣｌｕｓｔａｌＸ进行多序列比对，以酒类　

酒球菌和魏斯氏菌作为外群，用ＭＥＧＡ４软件ＮＪ法构　

通过以上生理生化特性，初步确定该菌株为假肠　

膜明串珠菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ），命名为　

ｋｉｍｓｈｉ００５。　

建系统发生树。　

２结果与讨论　

２－３　１６Ｓ　ｒＤＮＡ的系统发育树分析　

１６Ｓ　ｒＤＮＡ具有功能和进化上的同源性，在整体结　

构上极端保守，其序列进化变异频率缓慢，携带有充分　

２．１菌株形态特征　

在ＭＲＳ固体培养基上生长３６　ｈ后，得到灰白色　

的生物信息可用来进行可靠的系统进化分析。准确定　

生物工程　金红星

等：土壤中明串珠茵的筛选与鉴定　

，

表２不同碳水化合物利用实验　

Ｔａｂｌｅ　２　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　

碳水化合物　

半乳糖　

纤维二糖　

密二糖　

乳糖　

麦芽糖　

蔗糖　

果糖　

Ｌ一阿拉伯糖　

海藻糖　

甘露糖　

Ｄ一木糖　

棉籽糖　

＋＋＋　：　

Ｌ一鼠李糖　

核糖　

甘露醇　

水杨苷　

注：“＋”表示阳性；“一”表示阴性；“ｄ”表示延时；“Ｗ”表示弱阳性。　

位细菌菌株的分离地位时经常采用这一方法唧。　

ｋｉｍｓｈｉＯ０５菌株１６Ｓ　ｒＤＮＡ碱基序列的系统发育树　

见图２。　

０．０２　

图２　１６Ｓ　ｒＤＮＡ的系统发育树　

Ｆｉｇ．２　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　

从图２可以看出，该菌株与假肠膜明串珠菌　

１４５＝＝　－　

（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＦ５１５２２８具有较高　

的同源性，确定为假肠膜明串珠菌，其１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列　

在ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号为ＧＵ１３０１９５。　

明串珠菌的生境较为宽泛，主要存在于植物的表　

面和根部，因此本研究从植物根系周围的土壤中分离　

筛选明串珠菌。土样采自河北省沽源县坝上高原金莲　

山区林下，去除了上层腐质层土壤，土质优良。韩国泡　

菜的研究表明，白菜是繁殖明串珠菌的很好的栖息　

地ｎ】。利用这一特性富集了土样中的明串珠菌。另外，　

明串珠菌耐氧、耐盐，因此本研究中用３％的盐溶液浸　

泡白菜，同时采用无氧封闭条件进行富集培养，有助于　

对杂菌的去除和明串珠菌的筛选。　

３结论　

从山区林下土壤中分离筛选出一株明串珠菌，参　

照《伯杰氏细菌鉴定手册》第８版和《乳酸细菌分类鉴　

定及实验方法》，通过形态特征和生理生化特性以及　

１６Ｓ　ｒＤＮＡ的系统发育树分析，确定该菌株为假肠膜明　

串珠菌，将其命名为ｋｉｍｓｈｉ００５，在ＧｅｎＢａｎｋ中的登录　

号为ＧＵ１３０１９５　

参考文献：　

【ｌ】．Ｈａｎ　Ｈｏｎｇ－Ｕｉ　Ｋｉｍｃｈｉ．伟大的遗产：韩文［Ｍ］．首尔：Ｈａｎｕｌ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　

ｃｏｍｐａｎｙ，２００６：１　

［２］Ｈｅｍｍｅ　Ｄ，Ｆｏｕｃａｕｄ　Ｃ．Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｕｓｅ　ｉｎ　ｄａｉｒｙ　

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｏｏｄ　ｃ刀．ＩｎｔＤａｉｒｙＪ，２００４，１４（６）：　

４６７—４９４　

［３】高莉莉．明串珠菌的筛选及其生理代谢特性研究【Ｄ］．保定：河北　

农业大学，２００５：４　

【４］凌代文．乳酸细菌分类鉴定及实验方法【Ｍ】．北京：中国轻工业出　

版社，１９９９：１１７—１２０　

［５］Ｃｈａｎｇ　Ｊ　Ｙ，Ｌｅｅ　Ｈ　Ｊ，Ｃｈａｎｇ　Ｈ　Ｃ．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＫＦＲＩ４６４　ｔｈａｔ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｅ　ｃｉｔｒｅｕｍＧＪ７『Ｊ１．ＪＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，１０３　

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［６　金红星，６］田方，成文玉．辣白菜中明串珠菌的筛选及鉴定［Ｊ］．中国　

酿造，２００９（８）：８２—８４　

［７】Ｂｕｃｈａｎａｎ　Ｒ　Ｅ．伯杰细菌鉴定手册：中文版［Ｍ］．８版．北京：科学出　

版社，１９８４：７０２—７０７　

［８］Ｋｉｍ　Ｌ　Ｃｈｕｎ　Ｊ，Ｈａｎ　Ｈ　Ｕ．Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｋｉｍｃｈｉｉ　ｓｐ　ｎｏｖ，ａ　ｎｅｗ　ｓｐｅｃｉｅｓ　

ｆｒｏｍ　ｋｉｍｃｈｉ叨．ＩｎｔＪ　Ｓｙｓｔ　Ｅｖｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２Ｏ００，５０（５）：１９１５—１９１９　

［９］Ｃａｉ　Ｙｉｍｉｎ，Ｂｅｎｎｏ　Ｙ，Ｔａｋｅｄａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　

ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｖａｃｕｕｍ－ｐａｃｋａｇｅｄ　ｈａｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｇｅｎ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．　

１９９８，４４（２）：１５３—１５９　

收稿日期：２０１０—０９—２２