干扰ELK-3抑制人肝癌细胞的上皮-间质转换|江阴雨辰互联

2023年7月17日发(作者：)

干扰ELK-3抑制人肝癌细胞的上皮-间质转换

李天柱;史铁伟;周静;金光虎;张俊毅;郝丹丹;白春英

【摘要】Objective To investigate the relationship of ELK-3 and epithelial-mesenchymal transition ( EMT) for ex-ploring its possible

mechanism .Methods The human hepatocellular carcinoma cells ( HCC)

were divided into small interference RNA transfection group and Ras-ELK-3 pathway inhibitor group .The protein level of ELK-3 target gene EGR-1 E-cadherin ,vimentin and p38 in HCC were determined by Western blot

analysis .Results The protein level of ELK-3 and its target gene EGR-1 in

treated human hepatocellular carcinoma cells significantly decreased as

compared with the negative control group (P<0.01).The protein level of E-cadherin was significantly increased (P<0.01), while vimentin and p38 were

decreased in HCC cells with ELK-3 interference (P<0.01).Conclusions ELK-3

in-terference can inhibit the epithelial-mesenchymal transition of HCC cells

by down-regulating p38.%目的：研究转录因子ELK-3与人肝癌细胞系HepG2和HuH7上皮-间质转换（ EMT）的关系及其作用机制。方法将HepG2和HuH7细胞分为小干扰RNA转染组和Ras-ELK-3信号通路抑制剂（ XRP44X）处理组。用West-ern blot检测ELK-3、ELK-3靶基因EGR-1以及EMT相关分子钙黏附素E（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）的表达和MAPK信号通路蛋白p38的表达。结果 ELK-3干扰或Ras-ELK-3信号通路抑制剂（ XRP44X）处理肝癌细胞后其ELK-3和ELK-3的靶基因EGR-1的蛋白表达均显著降低（P＜0.01），E-cadherin表达水平升高（P＜0.01），vim-entin的表达及p38磷酸化水平均降低（ P＜0.01）。结论通过干扰ELK-3下调p38抑制EMT。【期刊名称】《基础医学与临床》

【年(卷),期】2017(037)002

【总页数】6页(P211-216)

【关键词】ELK-3;肝癌细胞;上皮间质转换;p38

【作者】李天柱;史铁伟;周静;金光虎;张俊毅;郝丹丹;白春英

【作者单位】赤峰学院医学院分子医学研究中心，内蒙古赤峰024000;赤峰学院医学院分子医学研究中心，内蒙古赤峰024000;赤峰学院医学院分子医学研究中心，内蒙古赤峰024000;赤峰学院医学院分子医学研究中心，内蒙古赤峰024000;赤峰学院医学院分子医学研究中心，内蒙古赤峰024000;赤峰学院医学院分子医学研究中心，内蒙古赤峰024000;赤峰学院医学院分子医学研究中心，内蒙古赤峰024000

【正文语种】中文

【中图分类】R735.7

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是易复发、易转移的恶性程度和病死率高的肿瘤之一[1]。肝癌的主要危险因素有乙肝病毒、酒精、肝纤维化[2]、肝硬化等。近年来，研究发现上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肝癌的侵袭和转移中起到关键性作用[3- 4]。

转录因子ELK- 3(又称Net)是Ras-MAPK信号通路下游靶点，在生理和病理过程中起着重要的作用，包括伤口愈合、细胞迁移和血管生成等[5]。前期研究发现，

ELK- 3在转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导的上皮-间质转换细胞模型中，通过调节TGF-β1/MAPK信号通路促进EMT的进行，进而调节肝纤维化的进行[6]。但是，ELK- 3与肝癌的相关研究尚未见报道。结合前期研究基础，推测ELK- 3可能在肝癌的发生中也起到类似的作用。

本研究检测肝癌细胞中ELK- 3与ELK- 3靶基因EGR- 1，以及EMT相关分子E-cadherin与vimentin的蛋白表达和 MAPK信号通路蛋白(JNK，ERK，p38)的表达，探讨ELK- 3与人肝癌细胞EMT间的关系及其作用机制。

1.1 材料

1.1.1 细胞：人正常肝细胞系L02、人肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞(中科院上海细胞库)。

1.1.2 试剂：RPMI- 1640、DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司)；LipofectamineTM 2000(Invitrogen 公司)；BCA- 100蛋白质定量试剂盒 (上海申能博彩生物科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物)；ECL化学发光检测试剂盒(北京康维世纪公司)；0.25%胰蛋白酶(杭州吉诺生物公司)；ELK- 3

(Abcam公司)；Ras-ELK- 3 信号通路抑制剂-XRP44X(EMD Millipore

Corporation，Billerica公司)；ELK- 3 siRNA、JNK 和ERK(Santa Cruz

Biotechnology公司)；E-cadherin、vimentin、EGR- 1、pJNK、pERK、p38和pp38(Cell Signaling Technology公司)；β-actin(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：将L02细胞用含10% 胎牛血清的RPMI- 1640培养基，HepG2和HuH7细胞用含10% 胎牛血清DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度。细胞分为小干扰RNA转染组和Ras-ELK- 3信号通路抑制剂(XRP44X)处理组。

1.2.2 小干扰RNA(siRNA)转染：实验设立阴性对照组(control-siRNA)和ELK- 3干扰组(ELK- 3-siRNA)。转染前，将HuH7和HepG2细胞以2 ×105/孔接种于6孔板中，并将细胞培养基换成不含血清和抗生素的新鲜培养基，ELK- 3干扰组和阴性对照组，用ELK- 3-siRNA和control-siRNA分别与LipofectamineTM

2000转染试剂混合后，按说明书进行操作。转染后48 h，抽提细胞蛋白，利用Western blot检测ELK- 3、ELK- 3靶基因EGR- 1、以及EMT相关分子E-cadherin和vimentin的表达和MAPK信号通路蛋白p38的表达。

1.2.3 Ras-ELK- 3信号通路抑制剂(XRP44X)处理：实验设立对照组和XRP44X处理组。HuH7和HepG2细胞以2 ×105/孔接种于6孔板中，并将细胞培养基换成不含血清和抗生素的新鲜培养基，然后处理100 nmol/L XRP44X，培养至48 h后，抽提细胞蛋白，利用Western blot检测ELK- 3、ELK- 3靶基因EGR- 1以及EMT相关分子E-cadherin和vimentin的表达。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：采用RIPA裂解缓冲液冰上裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度，每个样品取30 μg上样，10% SDS-PAGE、PVDF转膜、用含10%脱脂奶粉的 TBST 溶液封闭 1 h，分别用相应的E-cadherin抗体(1∶1 000)、vimentin抗体(1∶1 000)、ELK- 3抗体(1∶1 000)、EGR- 1抗体(1∶1 000)、ERK抗体(1∶1 000)、pERK抗体(1∶1 000)、p38抗体(1∶1 000)、pp38 MAPK抗体(1∶1 000)孵育，4 ℃冰箱中摇床孵育过夜，TBST 洗3次，加入HRP标记的相应二抗(1∶1 000) 37 ℃孵育1 h，TBST 洗3次，ECL显色，化学发光试剂检测目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用 Sigma Plot 2000软件进行数据分析，数值均采用均数±标准差表示，采用t检验进行显著性分析。

2.1 ELK- 3在人肝癌HuH7和HepG2细胞中的表达

与人正常肝细胞L02组相比，人肝癌细胞Huh7和HepG2中的ELK- 3蛋白表达水平显著升高(P<0.01)(图1)。

2.2 ELK- 3 siRNA对人肝癌HuH7和HepG2细胞EMT标志蛋白、ELK- 3和 EGR- 1蛋白表达的影响

HuH7细胞中干扰ELK- 3后，与阴性对照组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著升高(P<0.01)，vimentin的表达水平显著降低(P<0.01)，ELK- 3 和ELK- 3的靶基因EGR- 1的蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)(图2A)。

HepG2细胞中干扰ELK- 3后，与阴性对照组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著升高(P<0.01)，vimentin的表达水平显著降低(P<0.01)，ELK- 3

和ELK- 3的靶基因EGR- 1的蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)(图2B)。

2.3 Ras-ELK- 3信号通路抑制剂对人肝癌HuH7(A)和HepG2(B)细胞EMT标志蛋白、ELK- 3和 EGR- 1蛋白表达的影响

HuH7细胞中处理Ras-ELK- 3信号通路抑制剂(XRP44X)后，与对照组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著升高(P<0.01)，vimentin的表达水平显著降低(P<0.01)，ELK- 3 和ELK- 3的靶基因EGR- 1的蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)(图3A)。

HepG2细胞中处理Ras-ELK- 3信号通路抑制剂(XRP44X)后，与对照组相比，EMT标志蛋白E-cadherin的表达水平显著升高(P<0.01)，vimentin的表达水平显著降低(P<0.01)，ELK- 3 和ELK- 3靶基因EGR- 1的蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)(图3B)。

2.4 ELK- 3 siRNA对人肝癌HuH7(A)和HepG2(B)细胞JNK、ERK和p38磷酸化水平的影响

HuH7细胞中干扰ELK- 3后，与阴性对照组相比，p38的磷酸化表达水平显著降低(P<0.01)(图4A)。

HepG2细胞中干扰ELK- 3后，与阴性对照组相比，p38的磷酸化表达水平显著降低(P<0.01)(图4B)。

迄今已证明，在肝癌的发生、进展中存在EMT现象，并且与肝癌的侵袭转移关系密切[7- 8]。ELK- 3与ELK- 1和Sap- 1形成三元复合物的转录因子家族(ternary

complex transcription factor subfamily，TCF)，在静止期细胞受到生长因子的刺激时参与早期反应[9]。ELK- 3的靶基因EGR- 1参与伤口愈合、免疫反应[10]。

前期研究首次阐明了ELK- 3和靶基因EGR- 1在EMT中起着重要作用，ELK- 3可通过调控TGF-β1/p38促进肝纤维化的进行[6]。本研究结果显示，ELK- 3通过调控p38，影响上皮与间质标志分子的表达，参与人肝癌细胞EMT的发生。

在EMT的发生过程中，具有极性的上皮细胞向具有移动能力的间充质细胞发生转化，同时伴有细胞标志物的改变[11]。主要表现为上皮标志物，如E-cadherin、ZO- 1等表达降低；间质标志物，如vimentin、 N-cadherin等表达升高。研究结果表明，ELK- 3在肝癌HuH7和HepG2细胞中过表达，提示ELK- 3可能在参与肝癌细胞的生物学行为过程中发挥重要作用。干扰ELK- 3或处理Ras-ELK- 3信号通路抑制剂使上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平升高，间质标志物vimentin的蛋白表达水平降低。提示，ELK- 3可能调节肝癌细胞的上皮间质化。同时，靶基因EGR- 1的蛋白表达水平也降低。进一步研究表明，干扰ELK- 3 使p38磷酸化表达水平降低。提示，ELK- 3通过调控p38影响上皮间质化。

综上所述，本研究显示，干扰ELK- 3通过下调p38使E-cadherin表达水平升高、vimentin表达水平降低，进而抑制人肝癌细胞的上皮-间质转换。

【相关文献】

[1] Hernandez-Gea V，Toffanin S，Friedman SL，et of the microenvironment in

the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology，2013，144:512- 527.

[2] Li TZ，Kim JH，Cho HH，et eutic potential of bone-marrow-derived

mesenchymal stem cells differentiated with growth-factor-free coculture method in liver-injured rats [J].Tissue Eng Part A，2010，16:2649- 2659.

[3] Ding W，You H，Dang H，et lial-to-mesenchymal transition of murine liver

tumor cells promotes invasion[J].Hepatology，2010，52:945- 953.

[4] Sun Y，Song GD，Sun N，et overexpression induces stemness and promotes

hepatocellular carcinoma cell invasion and metastasis[J].Oncol Lett，2014，7:1936- 1940.

[5] Buchwalter G，Gross C，Wasylyk ternary complex factor Net regulates cell

migration through inhibition of PAI- 1 expression[J].Mol Cell Biol，2005，25:10853-