2024年4月27日发(作者：htc x9u)

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＿　Ｃ　Ｔ　●　

ＪＢＲＩＣＵＬＴＵＲＡＥ　

ＢＯＲＥＪＬＩ－ＳＩＨＩ∞　

华北农学报・２００６，２１（增刊）：５０．５３　

适宜苹果组培苗总ＲＮＡ提取方法的研究　

张　鑫，杜国强，师校欣　

（河ｊＥ农业大学园艺学院，河ｊＥ保定０７１００１）　

摘要：利用ＣＴＡＢ．异硫氰酸胍法、改良ＣＴＡＢ法和ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法，从富含多糖和酚类物质的苹果组培苗继代　

苗中提取总ＲＮＡ。结果表明ＣＴＡＢ．异硫氰酸胍法对苹果组培苗总ＲＮＡ的提取有较好的效果，所得ＲＮＡ的Ａ２６０／Ａ２３０大　

于２．０，Ａ２６０／　为１．８—２．０，产率在１６．９５　ｇ／ｇ左右。改良ＣＴＡＢ法和ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法提取的ＲＮＡ均有少量ＤＮＡ　

污染，但ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法比ＣＴＡＢ法更快捷，简便。　

关键词：苹果；总ＲＮＡ；提取方法；组培苗　

中图分类号：￥６６１．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００—７０９１（２ｏ０６）增刊一００５０—０４　

Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　

ｏｆ　Ａｐｐｌｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ／ｎ　ｖｉｔｒｏ　

ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｎ，ＤＵ　Ｇｕｏ—ｑｉａｎｇ，ＳＨＩ　Ｘｉａｏ—ｘｉｎ　

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ　０７　１００１，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ＣＴＡＢ．ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｏｄ，ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　

ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｄｅｔｓ　ｏｆ　ａｐｐｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎ　ａ　ｌｏｔ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍ．　

ｐｏｕｎｄ．　Ｉ１１ｅ　Ｃ　ＩＩＡＢ－ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｔｅｒｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｙｉｅｌｄｅｄ　ＲＮＡ’ｖｉｔｌｌ　

ｔｈｅ　Ａ２印／Ａ２３０　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　２．０，Ａ２６ｏ／Ａ２￣０　ｒｎａｇｅｄ　ｆｒｏｍ　１．８　ｔｏ　２．０，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｏｔｌａ　ＲＮＡ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　１６．９５ｇｇ／ｇ．　ｅ　

ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ＣＴＡＢ　ａｎｄ　ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ　ａ　ｂｉｔ　ｓｈｏｒｔ　ｉｎ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｌｉｔｔｌｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔａｍｉｎａ．　

ｔｉｏｎ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｆａｓｔｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ．　

Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ａｐｐｌｅ；Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　

苹果组织ＲＮＡ的分离和纯化是进行苹果分子生　

物学研究的前提条件，如进行ｍＲＮＡ差异显示（ｍＲＮＡ　

１材料和方法　

ＤＤＲＴ—ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ文库的构建、ＲＴ—ＰＣＲ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　

１．１供试材料　

印迹研究等均需要提取高质量的ＲＮＡＬｌ　Ｊ。苹果组织中　转ＣｐＴＩ基因苹果（Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ　Ｂｏｒｋｈ）组培　

含有大量的多糖及酚类物质。多糖的许多理化性质与　苗，品种为红富士（Ｆｕｊｉ）和皇家嘎拉（Ｒｏｙａｌ　Ｇａｌａ），继　

ＲＮＡ相似，在提取过程中能与ＲＮＡ形成共沉淀　；酚　代培养３０—４０　ｄ，用于ＲＮＡ提取。　

类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质，与ＲＮＡ不　

１．２总ＲＮＡ的提取与检测　

可逆结合，从而影响ＲＮＡ的分离纯化Ｌ３Ｊ，降低ＲＮＡ提　

１．２．１　ＣＴＡＢ．异硫氰酸胍法　提取缓冲液含２％　

取的质量和数量。前人对从芒果［引、葡萄［　、棉花［６．７］　

ＣＴＡＢ，４　ｍｏｌ／Ｌ异硫氰酸胍，２　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，２％ＰＶＰ．　

河套蜜瓜Ｌ８Ｊ等中提取总ＲＮＡ的方法有所研究，本试验　

４０，２％　一巯基乙醇（用前加入），１００　ｅｒｏｔｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ．ｃｌ，　

对从苹果组培苗中提取总ＲＮＡ的适宜方法进行了探　

２０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，２５０　ｇｇ／ｍＬ糖原。称取０．１　ｇ叶　

讨，以期为进一步开展苹果组培苗分子生物学研究提　

片，液氮下充分研磨，迅速转入１．５　ｍＬ离心管中，每　

供有利条件。　管加入１　ｍＬ　６５℃提取液，漩涡震荡混匀，于６５℃水　

收稿日期：２００６—０７—０１　

基金项目：河ｊＥ省自然科学基金（Ｃ２００４０００３６８）；河ｊＥ农业大学博士、引进人才启动基金资助项目　

作者简介：张鑫（１９８０一），男，河ｊＥ邯郸人，在读硕士，主要从事果树生物技术研究；杜国强为通讯作者。　

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增刊　张鑫等：适宜苹果组培苗总ＲＮＡ提取方法的研究　５１　

ＨＲＩＯＵＬＴＵＲＡＥ　

ＢＯＲＨＬＩ－｜ＩＨＩ曲　

浴放置２０　ｍｉｎ，期间颠倒混匀２次。４￣Ｃ条件下　

１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ。取上清，加入１／２０体积５　

ｍｏｌ／Ｌ　ＫＡＣ（ｐＨ　５．５）和１／１０体积预冷的无水乙醇，　

轻轻颠倒混匀，４℃１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ。取上　

清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（２５：２４：１），冰浴　

１０　ｍｉｎ，４℃１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｗｉｎ。取上清，加入　

等体积的氯仿：异戊醇（２４：１），冰浴１０　ｍｉｎ，４℃　

１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ。取上清，加入１／１０体积３　

ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＡＣ（ｐＨ５．２）和２．５倍体积预冷的无水乙醇，　

混匀后冰浴３０　ｍｉｎ，４℃１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ。　

弃上清，７５％乙醇洗涤沉淀２次，室温下自然干燥。　

１．３　ＲＴ．ＰＣＲ反应　

在５０　反应体系中，先加入总ＲＮＡ　０．１　，下　

游引物２５　ｐｍｏＬ，用双蒸水补至２７　。７０℃保温５　

ｍｉｎ后立即置于冰上。加入ｄＮＴＰ，Ｍ—ＭＬＶ，ＲＮａｓｉｎ，　

使其终浓度分别为０．４　ｍｍｏ￣Ｌ，４　ｕ／　和０．５　

Ｕ／ｖＬ。再加入１０ｘ　ＲＴ　Ｂｕｆｆｅｒ　５　，用双蒸水补足至　

５０　。４２￣Ｃ保温１ｈ，７０℃１０　ｍｉｎ灭活反转录酶。取　

２　ｔｔＬ　ｃＤＮＡ产物进行ＰＣＲ扩增。５　端特异引物序　

列：ｃｔａａａｇｇｔｇｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇｔａ，３　端特异引物序列：　

ａａｇｔｃｃａｇｇｇａｔｇａａｇａｔｇａｔ。２５　Ｌ反应体系中，上游引物　

２５／ｚｍｏｌ／Ｌ，下游引物２５／ｚｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ　０．２　ｍｍｏｌ／Ｌ，　

Ｔａｑ酶０．０５　ｕ／　，２．５￣．ＬＩＯ×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ。ＰＣＲ扩增　

加入适量ＤＥＰＣ水，沉淀溶解后一７０℃保存备用　

Ｏ　

条件为９４￣Ｃ预变性５　ｍｉｎ，３０个循环ＰＣＲ扩增（９４￣Ｃ　

变性３０　Ｓ，５５℃退火３０　Ｓ，７２℃延伸１　ｍｉｎ），最后７２℃　

１．２．２改良ＣＴＡＢ法　提取缓冲液含２％ＣＴＡＢ，２　

ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，４％Ｊ３一巯基乙醇（用前加入），１００　

ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—Ｃ１，２０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ。试验流程同上述　

延伸１０　ｍｉｎ。产物在１％ＴＡＥ琼脂糖凝胶中电泳检　

测。　

ＣＴＡＢ一异硫氰酸胍法。　

１．２．３　ＲＮＡｐｌ￣ｔ试剂盒法取０．１ｇ叶片，液氮下　

２结果与分析　

２．１　３种方法所提总ＲＮＡ的电泳图谱　

检验ＲＮＡ完整性的常规方法是高压快速电泳。　

充分研磨，迅速转入１．５　ｍＬ离心管中，加入０．５　ｍＬ—　

ＲＮＡｐｌａｎｔ提取试剂，振荡至彻底混匀。室温放置５　

ｍｉｎ。室温１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ。取上清，加０．１　

在较短时间内，使ＲＮＡ电泳完毕，防止ＲＮＡ降　

解＿８　Ｊ。理论上，如果ＲＮＡ没有被降解，应该出现３　

条带，即２８Ｓ　ｒＲＮＡ带、１８Ｓ　ｒＲＮＡ带以及由５．８Ｓ　

ｒＲＮＡ，５Ｓ　ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ组成的带Ｌ９　Ｊ，并且２８Ｓ　ｒＲＮＡ的　

亮度是１８Ｓ　ｒＲＮＡ亮度的２倍。本试验结果表明，经　

ｍＬ　５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，温和混匀，再加０．３　ｍＬ氯仿，上下　

颠倒混匀。４℃１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ。取上清，　

加等体积异丙醇，室温放置１０　ｍｉｎ。４℃１２　０００　ｒ／ｍｉｎ　

离心１０　ｍｉｎ，弃上清，加１　ｍＬ　７５％乙醇洗涤沉淀。　

加入适量ＤＥＰＣ水，沉淀溶解后一７０℃保存。　

１．２．４　总ＲＮＡ的检测　取４　ｕＬ上述方法所提总　

ＣＴＡＢ一异硫氰酸胍法提取的总ＲＮＡ，其２８Ｓ　ＲＮＡ，１８Ｓ　

ＲＮＡ和５Ｓ　ＲＮＡ　３条带清晰可见（图１．Ａ），无ＤＮＡ污　

染，完整性好，质量高；采用改良ＣＴＡＢ法提取的总　

ＲＮＡ，其２８Ｓ　ＲＮＡ，１８Ｓ　ＲＮＡ和５Ｓ　ＲＮＡ　３条带清晰可　

见，但有ＤＮＡ污染（图１．Ｂ）；采用ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒　

ＲＮＡ，在１％ＴＡＥ琼脂糖凝胶中进行电泳，检测ＲＮＡ　

的质量。取总ＲＮＡ　５　ｌ稀释后利用紫外分光光度计　

检测，记录Ａ２３０，Ａ２印和Ａ２８０值，并计算Ａ２６０／Ａ２３０和　

Ａ２６（）／Ａ２８０。　

法提取的总ＲＮＡ，其２８Ｓ　ＲＮＡ和１８Ｓ　ＲＮＡ　２条带清　

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●　Ｃ　Ｔ　●一　

ＨＲＩＣＵＬＴＵＲＩＥ　５２　

Ｄ０ｌＥ●Ｕ－｜ＩＨＩＣ＿一　

华北农学报　２１卷　

２．２　ＲＮＡ浓度及纯度的检测　

ＯＤ２ｓ０值为１．８—２．０；改良ＣＴＡＢ法提取的ＲＮＡ其　

ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值为１．７—１．９；ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法提取　

的ＲＮＡ其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值为１．６—１．８。３种方法提　

取ＲＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤｚ３ｏ值均大于２．０（表１）。而以　

ＣＴＡＢ．异硫氰酸胍法提取的ＲＮＡ纯度高，改良ＣＴＡＢ　

法和ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法提取的ＲＮＡ纯度次之。　

ＲＮＡ的浓度可通过测定其ＯＤ２６０值来确定，而　

ＲＮＡ的纯度可以通过ＯＯ：６０，ＯＤ２８０，ＯＤ２３ｏ的比值来确　

定。纯度好的ＲＮＡ，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值应该１．７—２．０　

之间，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０的比值应该大于２．０［　。本研究结　

果表明，ＣＴＡＢ一异硫氰酸胍法提取的ＲＮＡ其ＯＤ２６ｏ／　

表１不同方法提取ＲＮＡ的产量和质量　

Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄｓ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　

２．３　ＲＴ－ＰＣＲ分析　

放出来。将Ｂ．巯基乙醇与ＰＶＰ．４０联合使用，可以更　

加有效地防止酚类物质的氧化，从而阻止酚类物质　

氧化产物与ＲＮＡ的不可逆结合，进而去除酚类物质　

的影响【ｌ引。而对于多糖的影响，此方法通过加入高　

浓度ＫＡｃ，改变多糖溶解性，使其主要分配在有机相　

中，再经苯酚和氯仿抽提，可除去大部分多糖；同时　

经低浓度乙醇（１０％　３０％）处理也可沉淀部分多　

糖【４　；加入的糖原可以提高核酸的产量和质量。改　

良ＣＴＡＢ法所提取总ＲＮＡ的质量、纯度等，比ＣＴＡＢ．　

异硫氰酸胍法稍差，其操作流程与ＣＴＡＢ．异硫氰酸　

胍法操作相同，但提取缓冲液中不含异硫氰酸胍、　

ＲＴ－ＰＣＲ是基因克隆、转基因植物分子鉴定等研　

究的重要方法之一，对ＲＮＡ的纯度和质量有较高要　

求。为了验证ＣＴＡＢ．异硫氰酸胍法、改良ＣＴＡＢ法　

和ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法提取苹果组培苗ＲＮＡ的可用　

性，利用　”基因的特异性引物，以这３种方法提　

取的ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ反应（ＣＴＡＢ．异硫氰　

酸胍法提取的ＲＮＡ直接ＲＴ．ＰＣＲ，改良ＣＴＡＢ法和　

ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法提取的总ＲＮＡ经ＤＮａｓｅ　Ｉ去除　

ＤＮＡ后进行ＲＴ．ＰＣＲ）。结果都得到了３００　ｂｐ左右　

的片段，电泳条带清晰一致（图２）。说明上述３种　

方法提取的ＲＮＡ可用于特定基因的ＲＴ．ＰＣＲ检测。　

１　２　３　４　

ＰＶＰ－４０和糖原，因此实验成本较低。ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂　

盒是以传统的“一步法”为原理设计的，其提取过程　

快速、简便，产物的质量、纯度等均符合实验要求，可　

用于进一步的实验研究。此方法适用于大量而快速　

的制备ＲＮＡ样品。改良ＣＴＡＢ法和ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂　

步去除，因此在操作上比ＣＴＡＢ．异硫氰酸胍法略　

盒所提取的总ＲＮＡ中含有ＤＮＡ，需要经ＤＮａｓｅ　Ｉ进　

一

■三　１５３０ｂｐ　

１．ＣＴＡＢ一异硫氰酸胍法２．改良ＣＴＡＢ法　

显繁琐。　

由于不同植物种类以及同种植物的不同组织内　

３．ＲＮＡｐｌａｎｔ试剂盒法４．１００　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　Ｍａｒｋｅｒ　

１．ＣＴＡＢ—ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍｍｅｔｈｏｄ　２．Ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　

３．ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ　４．１００　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　Ｍａｒｋｅｒ　

所含物质组分及含量有很大差别，往往需要不同的　

ＲＮＡ提取方法【ｌ引，适合不同材料ＲＮＡ提取的通用　

方法并不多，对不同种类富含多糖和酚类物质植物　

的总ＲＮＡ提取依然有难度。因此，针对每一种材　

料，其ＲＮＡ的提取仍需经过试验和摸索，以找到最　

适宜的方法。　

参考文献：　

图２不同方法提取ＲＮＡ的ＲＴ—ＰＣＲ凝胶电泳图谱　

Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　

ＲＮＡ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｅｔｈｏｄｓ　

３讨论与结论　

在上述３种提取苹果组培苗总ＲＮＡ的方法中，　

ＣＴＡＢ．异硫氰酸胍法为较理想的方法。此方法将异　

［１］　Ｓａｍｂｒｏｏｌ　Ｊ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ，Ｆｒｉｔｃｈ　Ｅ　Ｆ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　

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硫氰酸胍及ＣＴＡＢ［加　］联合使用，可使蛋白质变性　

更加完全，细胞裂解更加彻底，从而将ＲＮＡ完全释　

［２］Ｌｏｇｅｍａｎｎ　Ｊ，Ｓｃｈｅｌｌ　Ｊ，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　Ｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　

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＿　

Ｌ！Ｉ　

１Ｊ　１｛１Ｊ　

－　０　Ｔ　－　

增刊　张　鑫等：适宜苹果组培苗总ＲＮＡ提取方法的研究　

ＩＩＣＵｔｌＵＲＩＥ　

５３　

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