2024年4月25日发(作者：mk18)

5生物工程进展62002,Vol.22,No.1

研究进展

溶栓剂研究的新进展

焦建伟 茹炳根

(北京大学生命科学学院蛋白质工程国家重点实验室北京 100871)

摘要 近年来对溶栓剂的研究取得了很好的成果,主要集中在单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scu2

PA),组织型纤溶酶原激活剂(t2PA),葡萄球菌激酶(SAK)等,对分子进行设计改造,保留它们高效

的溶栓功能同时赋予新的功能。在对分子空间结构域和活性功能区分析的基础上,研制出更有效

的、更安全的溶栓制剂具有广阔的发展前景。

关键词 溶栓剂 血栓 蛋白质工程

随着心脑血管疾病发病率的提高,使得有关溶

栓药物的研究成为热点。

正常情况下,血液中的凝血系统和纤溶系统处

于动态的平衡过程中,两者相互制约。在病理条件

下,体内的凝血系统和纤溶系统处于不正常的比例

状态,体内的活性纤溶酶量不足以分解形成的纤维

蛋白(血栓),就需要采取相应的措施以保证血液循

环的正常畅通。目前治疗血栓病的主要方法就是溶

栓疗法,即注射溶栓剂使血管再通,这种方法的优点

是治疗后两周内死亡率较低。因此研究高效的溶栓

药物在临床上具有重要意义。

目前临床上已正式批准使用和试用的溶栓剂

有:组织型纤溶酶激活剂(t2PA)、尿激酶原(pro2

UK)、重组t2PA(rt2PA)、对2甲氧苯甲酚纤溶酶原链

激酶激活剂复合物(APSAC)、重组型葡萄球菌激酶

(STAR)、和TNK2tPA等。

从溶栓剂开始作为药物使用到现在,溶栓剂的

开发基本分为三代

[2]

[1]

酶原复合物,激活纤溶酶原。

第三代溶栓剂包括STAR、rt2PA,K1K2Pu、K2P

和TNK-PA等以及正在研制的新型溶栓剂。它们

基本具备以下特点:溶栓能力强,出血副作用小,在

血液中的半衰期长,总使用剂量少,治疗费用低等。

第一代溶栓分子具有自身难以克服的缺陷如出

血负作用大等,已经被淘汰。第二代溶栓剂已经有

所改进,但还不理想。因此,目前国际上正在致力于

用蛋白质工程手段开发第三代溶栓剂,研究方向是

在增强或保持其催化活性的前提下,通过对某些特

定氨基酸残基的突变或是通过相关结构域的删除、

增加或融合等手段,达到以下目标:1.提高对纤维蛋

白的选择性;2.提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗

性:3.延长其在血液循环中的半寿期;4.导向溶栓性

能;5.抗血栓形成。本文就对国内外在溶栓剂方面

的新进展作一综述。

1 分子的定点突变

组织型纤溶酶原激活剂(t2PA)是一种分子量

70kD,由527个氨基酸残基组成的丝氨酸蛋白酶,基

本分为5个独立的结构域,这就是F区、EGF区、K1、

K2及蛋白酶区。Bennett

[3]

。第一代溶栓剂包括链激酶

(SK)和尿激酶(UK),它们虽然具有有较好的溶栓效

果,但缺乏纤维蛋白选择性,除了能激活血栓表面的

纤溶酶原外也能激活血浆中游离的纤溶酶原,使a22

抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋白原降解,产生全身性

出血的副作用。且SK重复使用有过敏反应。

组织型纤溶酶原激活剂(t2PA)、尿激酶原(pro2

UK)和对-甲氧苯甲酰(茴香酰)纤溶酶原链激酶激

活剂复合物(APSAC)属于第二代溶栓剂。t2PA和

pro2UK体外和动物实验中都有明显的纤维蛋白亲

和性,出血副作用较小。APSAC为链激酶的换代产

品,在体外无溶栓活性,进入血液后,与纤维蛋白结

合后发生脱酰基水解反应,形成有活性的SK-纤溶

30

等用丙氨酸扫描突变的

方法构建了64种t2PA的突变体,研究发现F区、

EGF区和K2区的突变对血纤维蛋白的亲和性和刺

激作用都有影响。此外K2区对血纤维蛋白的热稳

定性及空间结构的维持也有重要贡献。K1区中

Arg125Pro,Arg164Ser,Thr165Ser突变体的活性比野

生型t2PA高3-4倍,Glyl282Pro131也可能参与t2PA

与纤维蛋白的结合,说明t2PA的K1结构域对t2PA

与血纤维蛋白结合的特异性也有影响,通过分子空

间三级结构域的比较也说明K1区具有类似的作

用。另外F区和EGF区也与t2PA在血液中的清除

速率有关

,删除了F区、EGF区的突变分子K2tu2

PA,其半衰期明显延长。

CollenD等构建了一个t2PA组合突变体,此突

变体综合了提高血纤维蛋白的专一性和降低了对

PAI21敏感性的KHRR2962299AAAA突变(K),降低

体内清除速率、半衰期延长的Thr103Asn突变(T),

和缺乏高甘露糖侧链的Asn117Gln突变(N)。实验

证明此突变体对血纤维蛋白的专一性增强了14倍,

抗PAI21能力提高了80倍,体内清除速率降低了10

倍,并减少了预凝集效应。

单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scu2PA或pro2

UK)是一种分子量为54kD,411个氨基酸组成的蛋

白酶,基本分为3个独立的结构域,即EGF区,K区

和蛋白酶区。通过定点突变验证了EGF区对u2PA

与u2PAR特异性结合具有重要作用,特别是Asn22,

Asn27,His29,Trp30具有不可替代的作用

。Eguchi

Y等将纤溶酶的作用位点Lys135突变为Gln,并将

纤溶酶激活位点和凝血酶失活位点附近的Phel57

突变为Asp,获得的突变体提高了对血栓选择性并

有很好的抗凝血酶和抗纤溶酶能力。单链尿激酶原

与双链尿激酶在溶栓性质上的差异可能与K区的

构象变化有关,删除了K区中Gly1502Argl56的突变

体不仅保留了尿激酶的溶栓活性,并极大地提高了

对血纤维蛋白的亲和性。

血液中存在着纤溶酶原激活剂的抑制剂以PAI

-1为主,PAI-1能与t2PA或u2PA形成摩尔比1B1

的复合物,使PA失活。定点删除突变证明缺失

Lys2962Gly302的突变体受PAI21抑制作用明显降

低,进一步的研究表明t2PA与PAI21的结合位点位

于其活性中心附近的Lys2962Arg299。在分析t2PA

结构的基础上,将结合位点附近的带正电荷的氨基

酸都替换为带负电荷的氨基酸,得到的突变分子t2

PAPR275E,R298E,R299E,R304E具有更强烈的抗

PAI-1抑制的特性

。根据t2PA和PAI21作用方

式的比较,预测u2PA上与pAI21作用位点可能与

Arg1792Ser184有关,并构建了删除了Arg1792Ser184

的突变体,证明突变体确实具有明显的抗PAI21抑

制的能力。

葡激酶(Staphylokinase,SAK)是由葡萄球菌产生

的一种蛋白质,由于具有较高的纤维蛋白的专一性

也成为研究的热点。葡激酶选择性地与血栓表面的

纤溶酶原形成分子比1B1的复合物,在血栓表面痕

[7]

[6]

[5]

[4]

量纤溶酶作用下,转变为活化的复合物,从而高效、

特异地溶解血栓。但由于葡激酶在人体中引起抗原

性反应,必须对其抗原决定簇进行改造。通过定点

突变将带电荷的氨基酸改变为Ala后得到的Sak2

STAR.M38(Lys35,Glu38,Lys74,Glu75,Arg77替换为

Ala)和SakSTAR.M89(Lys74,Glu75,Arg77,Glu80,

Asp82替换为Ala)抗原性明显降低,而且溶栓活性

不受影响

[8]

。

对于链激酶来说具有同样的在人体应用后产生

抗原性反应的问题,一种缺少C末端42个氨基酸的

链激酶的突变体(Skc2)将抗原性的问题大大降

[9]

低。

2 结构域的拼接

由于t2PA与纤维蛋白高亲和性和半衰期有关

的部位在A链(N端),scu2PA与高活性有关的部位

在B链(C端),基于以上考虑,设计了许多重组蛋

白。用完整的t2PA的A链和u2PA的B链构建了

tu2pA重组蛋白,但是对血纤维蛋白的亲和性比t2PA

低,活性与u2PA相当,可能是由于空间上的阻碍造

成的

[10]

。进一步的研究表明用t2PA的A链部分结

构域和u2PA的B链构建了一系列的重组蛋白得到

了很好的结果。其中K1K2tu2PA嵌合分子,半衰期

较长,同时保留了专一性的溶栓作用。FK2tu2PA和

K22tuPA两个重组蛋白,活性较高,抗PAI21能力也

较强,但纤维蛋白的亲和性略低。在兔静脉血栓模

型实验中FK2tu2PA溶栓能力与scu2PA接近,K2tu2

PA的溶栓能力显著高于t2PA和scu2PA。

总之通过结构域拼接的溶栓分子具有很大的开

发潜力。

3 导向溶栓剂

Runge等通过二硫键将t2PA与抗纤维蛋白的单

克隆抗体59D8偶联,杂合分子对纤维蛋白亲和性是

UK的100倍,是t2PA的10倍。体内实验则显示杂

合分子的溶栓能力比t2PA强2.8-9.6倍。此外,

还将scuPA232k与59D8通过分子重组构建了rscu2

PA232kP59D8,嵌合分子的溶栓能力比scuPA提高了

6倍,体内导向溶栓的性能明显增强,并具有一定的

抗栓能力

[11]

。

Tanake等利用膜连蛋白V(AnnexinV)构建了另

一类导向型溶栓分子。由于在血栓形成过程中血小

板活化后暴露出大量的磷酯酰丝氨酸,而AnnexinV

对磷酯酞丝氨酸具有很强的亲和性。将AnnexinV

31

和u2PA的B链通过二硫键偶合到一起得到了An2

nexin2uPA,体外溶栓实验表明杂合分子的活性与u2

PA相当,在大鼠肺栓塞的模型中的溶栓实验表明,

溶栓活性比u2PA高3-4倍。

由于血栓表面富含活化的血小板,将抗活化的

血小板表面糖蛋白GMP140的单克隆抗体SZ51,与

低分子量尿激酶原(scuPA232k)或尿激酶原(scuPA)

融合后获得了嵌合分子,体外分析表明两种嵌合分

[13]

子与血小板具有很高的亲和性。

除此之外,将抗纤维蛋白的单克隆抗体59D8和

抗血小板表面糖蛋白GPIIb/Óa的单克隆抗体7E3

与尿激酶进行偶联,获得了抗纤维蛋白-抗血小板

-尿激酶的偶合蛋白(BAAUC)。偶合分子对血小

板、GPIIb/IIIa以及纤维蛋白的亲和性分别是尿激

酶的10倍、58倍和13倍。偶合分子不但能高效地

溶解富含纤维蛋白的血凝块,而且高效地溶解富含

血小板的血栓,从而使导向溶栓的效果更明显、更理

想

[14]

[12]

的识别位点,RGD序列与血小板上受体CpÒbPÓa

结合后抑制血小板的聚集,纤维蛋白肽A(Glu82

Gly16)-识别并抑制凝血酶的活性位点,水蛭素C

端序列(Gly542Glu65)-识别凝血酶的结合位点,从

而阻碍凝血酶与其它底物的结合。体外实验表明

PLASTSTAR具有一定的溶栓活性,并能有效地抑制

凝血酶引起的血栓形成,但抑制血小板聚集的功能

不是很明显。但体内动物的静脉血栓和动脉血栓实

验中,重组分子表现出有效的抑制血小板聚集的功

能。

5 溶栓剂的前景

随着对溶栓剂分子空间结构和功能区域的研

究,许多具有高效溶栓能力的新一代溶栓剂相继被

开发出来。但使用溶栓剂后带来的出血倾向,以及

溶栓剂使用后再栓塞形成的趋势还需要去克服。对

溶栓剂的合理改造是保留分子已有的优势功能,并

且克服存在的缺陷,以及改造后不会带来不必要的

副作用。

理想的溶栓剂是综合各种优点于一体的完美结

合,将几个理想的溶栓剂的优点综合到一起的一种

广阔发展前景的溶栓剂。这也正是大多数溶栓实验

室现在需要去做的,总之,对溶栓剂的设计有待于进

一步的探索。

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(转第29页)

。

4 多功能溶栓剂

根据Arg2Gly2Asp(RGD)对血小板整合素有很强

的亲和性并设计了RGD2tPA突变分子,很好地提高

了突变分子对血小板的亲和性。我们实验室也构建

了尿激酶原2RGDS双功能分子,具有明显的抗血小

板聚集的功能,并且基本保留了溶栓活性

[15]

。

CHRP为纤维蛋白B链N端的四肽,将GHRP连

到scu2PA(Leu1442Leu411)的N端,得到的突变体对

纤维蛋白亲和力比scuPA232k有一定程度的提高,

同时具有抗纤维蛋白聚集的功能。

将水蛭素片段(Asn532Gln65)通过一段连接区与

scuPA240k(Ser472Leu411)重组得到的rscuPA240kDa2

hir分子,除了具有特异性的溶栓活性外,还赋予了

抑制凝血酶的功能,从而抑制凝血酶介导的血凝块

形成,并且重组蛋白有很高的血栓选择性,可能是重

组蛋白对结合在血凝块上的凝血酶有很高的亲和

性

[17]

[16]

。此外,通过化学偶连的方式将重组水蛭素与

链激酶融合在一起获得的偶合蛋白(SK2rHir)也取得

了很好的效果,与链激酶相比溶栓活性降低了7.9

倍,但对凝血酶的亲和性提高了17倍,同时能强烈

地抑制凝血酶的活性。

为了获得更有效的溶栓剂,一种同时拥有抗凝

血酶和抗血小板并且具有溶栓活性的重组葡激酶

(PLASTSAK)已经获得

[19]

[18]

。PLASTSTAR从N端到C

端分别是SAK(具有溶栓活性的葡激酶),FactorXa

32

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OntheResearchesofTransgenicPlantwithWinterFlounderAntifreezeProteinGene

Erden2DalaiWu,ZhuYe2rong,WangWen2yan

(DepartmentofBiology,InnerMongoliaUniversity,Hohhot 010021,PRC)

Abstract Ourstudiesabouttransformtobaccoplantwithwinterflounderantifreezeprotein(AFP)cDNAand

HuangYongfenetal..sreportontransformtomatoplantwiththesamegenewerere2evaluatedandthefactthatincreas2

ingcold2toleranceabilitiesmustbecorrelatedwithexpressionlevelofAFPgenewascriticalprobleminthetransgenic

eofextremelysimilarityconformationbetweenAFPandthecoldacclimationprotein,andboth

capableofformingamphipathicA2helices,mightcontributedirectlytofreezingtolerancebyprotectingcellsagainstthe

athatusingthecontrolsequencesofcis2act2

ingelementandtrans2actingfactorsofthecoldacclimationprotein,toregulateAFPgenes,aimedtoacquirefreezing2tol2

eranceintransgenicplants.

Keywords antifreezeproteins,coldacclimationprotein,transgenicplant

(接第32页)

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AdvancesontheThrombolyticAgentsResearch

JiaoJian2wei RuBing2gen

(NationalLaboratoryofProteinEngineering,CollegeofLifeSciences,PekingUniversity,Beijing 100871,China)

Abstract Thegreesearchaims

atthemodificationonthemolecularofscu2PA,t2PA,SAK,agentskeepthehighefficiencythrombosis

function,asisofanalysizingthestructuredomainandfunctionactiva2

tioncenter,ithasgoodrespecttodevelopmuchmoreefficientandsecurethrombolytictherapy.

Keywords thrombolyticagents,thrombus,proteinengineering

29