2024年4月23日发(作者：沃尔沃v40二手车)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.9

(22)申请日 2014.07.01

(71)申请人 杭州荐量兽用生物制品有限公司

地址 310018 浙江省杭州市杭州经济技术开发区10号大街266号

(72)发明人 李少丽

(74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公司

代理人 周世骏

(51)

C12N7/02

C12N7/00

(10)申请公布号 CN 104073472 A

(43)申请公布日 2014.10.01

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

一种去除PCV2病毒中支原体污染

的方法

(57)摘要

本发明涉及生物技术领域，旨在提

供一种去除PCV2病毒中支原体污染的方

法。该种去除PCV2病毒中支原体污染的

方法包括步骤：0.1μm滤菌器过滤PCV2

病毒并繁殖四代，PCV2病毒用终浓度

2.5μg/ml的Plasmocin处理两代，常规繁殖

PCV2两代。本发明采用先过滤再用抗生素

的方法，不仅节省了实验成本，更为重要

的是抗生素使用次数少，浓度小，去除支

原体时间短，整个处理过程仅需8代，约

16～20天可完成，且不会使PCV2病毒效

价降低，可为疫苗生产提供无支原体且病

毒效价高的PCV2病毒，并为单位体积内

疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代；

(2)PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代；

(3)常规繁殖PCV2两代；

所述步骤(1)具体包括下述步骤：

A、用含5％胎牛血清(PAA，A10209-1611)的MEM培养基(GIBCO，574131)培养

PK-15细胞，细胞密度为2×10⁵个/ml，将PCV2病毒用

养基中接种PCV2病毒，使PCV2

种PCV2病毒

0.1μm滤菌器过滤后，向MEM培

病毒接种量为MEM培养基体积的1％，然后将装有接

的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养

箱中，

B、将步骤A培养后的细胞瓶，进行冻融操作：将细胞瓶置于温度为-70℃的冰箱

中

C、再将细胞瓶进行步骤B的冻融操作两次，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶

D、将步骤A中的PCV2病毒替换成步骤C中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，再

依次重复步骤A、步骤B、步骤C的处理3次，即制得PCV2病毒；

中冻融好的PCV2病毒悬液；

冷冻12h，然后再取出细胞瓶置于常温(15～25℃)中融化；

培养72h；

所述步骤(2)具体包括下述步骤：

E、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵

个/ml，再向 MEM培养基中接种步骤(1)制得的PCV2病毒，使

积的1％，并向MEM培养

PCV2病毒接种量为MEM培养基体

基中加入Plasmocin(Invivogen，MPT-34-01B)，使Plasmocin的

终浓度为2.5μg/ml，然后将装有接种了PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，

37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，培养

步骤B中的冻融操

置于温度为

72～96h；细胞铺满后，将细胞瓶反复进行3次

作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；

F、将步骤E中的PCV2病毒替换成步骤E中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重

所述步骤(3)具体包括下述步骤：

G、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵

个/ml，再向 MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使

积的1％，然后将装有接种

复一次步骤E的操作，繁殖一代PCV2病毒；

PCV2病毒接种量为MEM培养基体

了PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度

为5％的培养箱中，培养72h；将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次步骤B中

的

H、将步骤G中的PCV2病毒替换成步骤G中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重

复一次步骤G的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的

冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；

PCV2病毒。

说 明 书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属，无囊膜，由

单股、共价的闭合环状DNA组成，病毒粒子直径约17nm，呈二十面体对

现的最小的一种脊椎动物病毒。该病毒可分为两种血清

对猪无致病性，广泛存在于猪体内

染病，如断奶仔猪多

不仅可

称，是目前发

型，即PCV1和PCV2。其中PCV1

和猪源传代细胞系中，PCV2可在猪群内引发多种传

系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等。PCV2

造成仔猪生长缓慢，还会侵害猪的免疫系统，导致猪群免疫抑制，直接引起其他

传染病免疫的失败，并引发其他病原的继发感染。PCV1基因组全长1759bp，

1767bp或1768bp，共包括ORF1和ORF2在内的11个开放阅

的ORF1编码与病毒复制有关的蛋白(Rep蛋白)，

白)，Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白，

病在流行病学诊断和疫苗研

PCV2为

读框。目前已证实，PCV2

ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap蛋

是刺激机体产生免疫应答的主要抗原，成为该

究中的热点。

我国自2000年首次报道猪群中存在PCV2感染，之后在全国各地陆续有报道，呈

逐 渐蔓延趋势。流行病学调查显示，目前我国猪群中PCV2阳性率高达

基因组也在不断发生变化，PCV2b基因型已取代

基因型毒株，猪群中PCV2的发生

的经济损失。

80％，且PCV2的

PCV2a基因型，成为当前流行的优势

率和严重程度也高于以前，给我国养猪业造成了巨大

疫苗免疫接种被认为是防控PCV2的有效手段，商品化疫苗的推广应用为有效防控

PCV2疫情发挥了重要作用。目前针对该病的国内外商品化疫苗主要为全病

亚单位疫苗和嵌合病毒疫苗，其中全病毒灭活疫苗使用

毒灭活疫苗、

得较为广泛。

无论是哪种类型的疫苗，获得纯净的病毒都是疫苗研究与生产的前提。但实际采集

病料的场所通常不能保证无菌，或在后续实验中，由于实验器材或者

带来污染，甚至可能是用已经污染支原体的细胞来培养

染支原体。对于PCV2病毒繁殖来说，支

产量，还会使培养的细胞遭

操作者本身及环境

病毒，会直接或间接造成病毒污

原体的污染不仅干扰了病毒的增殖，降低病毒

受污染，从而使研究结果的真实性和可靠性大大降低。

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之间，呈

高 度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。支原体约有1％

用普通染色法不易着色，因此在普通光学显微镜下不易可通过滤菌器，

被发现。

商品化的支原体抗生素Plasmocin主要用于治疗或预防细胞培养中支原体污染。

Plasmocin含有两种杀菌成分，可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌。

效果主要是其含有两种独特的抗菌成分，一种成分通过干扰核

合成受阻，另一种成分则通过干扰复制叉的形成

靶分子只存在于支原体和许多其他

它的显著

糖体的翻译功能而使蛋白

而阻止DNA的复制，而这两种成分的

细菌中而并不存在于真核细胞中。

使用推荐浓度5倍的高浓度Plasmocin处理细胞，虽未观察到药物对细胞新陈代谢

的副作用，但据此项试验检测，若在繁殖PCV2的过程中，细胞培养液中反

Plasmocin，则会使PCV2病毒效价降低。 复加入

PCV2大小17nm，0.1μm滤菌器过滤不会影响其毒价，而支原体直径一般在0.3～

0.5μm之间，由于其具有多形性，0.1μm滤菌器过滤后，不能彻底截留支原

量的支原体可用Plasmocin清除。所以单使用上述任何一种方

原体的同时保证PCV2病毒效价不降低。

体，残留少

法都不能保证彻底清除支

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种联合0.1μm滤菌器和

Plasmocin两种方法去除PCV2中污染的支原体。为解决上述技术问题，本

方案是： 发明的解决

提供一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，具体步骤包括：

(1)0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代；

(2)PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代；

(3)常规繁殖PCV2两代；

所述步骤(1)具体包括下述步骤：

A、用含5％胎牛血清(PAA，A10209-1611)的MEM培养基(GIBCO，574131)培养

PK-15细胞，细胞密度为2×10⁵个/ml，将PCV2病毒用0.1μm

养基中接种PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为

种PCV2病毒的MEM培养基的细

培养

滤菌器过滤后，向MEM培

MEM培养基体积的1％，然后将装有接

胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，

72h；

B、将步骤A培养后的细胞瓶，进行冻融操作：将细胞瓶置于温度为-70℃的冰箱

中

C、再将细胞瓶进行步骤B的冻融操作两次，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶

D、将步骤A中的PCV2病毒替换成步骤C中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，再

所述步骤(2)具体包括下述步骤：

E、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵

个/ml，再向 MEM培养基中接种步骤(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒

积的1％，并向MEM培养基中加入

终浓度为2.5μg/ml，

37℃、

依次重复步骤A、步骤B、步骤C的处理3次，即制得PCV2病毒；

中冻融好的PCV2病毒悬液；

冷冻12h，然后再取出细胞瓶置于常温(15～25℃)中融化；

接种量为MEM培养基体

Plasmocin(Invivogen，MPT-34-01B)，使Plasmocin的

然后将装有接种了PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为

CO₂浓度为5％的培养箱中，培养72～96h；细胞铺满后，将细胞瓶反

复进行3次

液；

F、将步骤E中的PCV2病毒替换成步骤E中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重

所述步骤(3)具体包括下述步骤：

G、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵

个/ml，再向 MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒

积的1％，然后将装有接种了PCV2病毒的

复一次步骤E的操作，繁殖一代PCV2病毒；

步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬

接种量为MEM培养基体

MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，

培养72h；将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次步骤B中的

作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；

H、将步骤G中的PCV2病毒替换成步骤G中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重

为检测制得的PCV2病毒中支原体的去除情况，对制备得到的PCV2病毒进行支原

体鉴定，具体方法为：参考猪支原体基因序列，Genbank登录号NR-

DNAMAN软件设计两对上下游引物：P1：

复一次步骤G的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。

冻融操

103095.1，采用

AAGTCGTAACAACCTATCCCTA，P2：

GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA；P3：GCAAGTCGATGAAGGACG，

用套式PCR法，以步骤H中制得

猪滑液囊支原

P4：GCTTCGCTCGCCACTACT,采

的PCV2病毒为样品模板，并设灭菌双蒸水为阴性对照，

体为阳性对照，先用P1和P2引物进行PCR扩增，将其扩增产物作为PCR

反应模板，再用P3和P4引物扩增目的基因片段，将第二次PCR扩增的产

脂糖凝胶电泳检测支原体。 物，用1％琼

为进一步检测制得的PCV2病毒经处理后，其病毒效价是否受到影响，采用IFA法，

即间接免疫荧光法，对制备得到的PCV2病毒进行

TCID₅₀测定，具体方法为：

先将PK-15细胞用MEM培养基稀释成密度为2×10⁵个/ml的细胞悬液，

细胞悬液加 入到96孔细胞培养板中，100μl/孔，再将步骤H中繁殖得到

稀释，选择的PCV2病毒10倍系列梯度

10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、

10^-6、10^-7这6个梯度，100μl/孔加到细胞悬液中，每

个梯度重复6个孔，同时设MEM培养液作阴性对照、

性对照，阴性、10^7.3TCID₅₀/ml的PCV2病毒作阳

阳性对照各1孔，然后将细胞培养板置于温度为37℃、5％浓度CO₂

的

培养结束后，取出细胞培养板并弃掉细胞培养板中的液体，每孔加入100μl冷的甲

醇-丙酮固定液(甲醇和丙酮体积比1:1配制)，然后在温度为-20℃的冰箱固

弃固定液，再用pH为7.4的PBST洗涤1次细胞培养板后甩

培养箱中，培养72h；

定30分钟，

干；

将鼠源Cap蛋白单克隆抗体用PBS进行1:2000倍稀释得到鼠源Cap蛋白单克隆抗

体稀释液，将鼠源Cap蛋白单克隆抗体稀释液按100μl/孔加入到甩干的细胞

然后将细胞培养板在37℃下摇床孵育60分钟，弃细胞培养板

的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；

培养板中，

中液体，再用pH为7.4

将FITC-羊抗鼠二抗用PBS进行1:200倍稀释得到FITC-羊抗鼠二抗稀释液，将

FITC-羊抗鼠二抗稀释液按100μl/孔加入到甩干的细胞培养板中，锡箔纸包

板避光，然后将细胞培养板在37℃下摇床孵育60分钟，弃细

为7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；

裹细胞培养

胞培养板中液体，再用pH

将甩干的细胞培养板于倒置荧光显微镜下观察，按Reed和Muench法计算PCV2

本发明的工作原理：联合0.1μm的滤菌器和Plasmocin两种方法去除PCV2中污染

的 支原体，先用0.1μm的滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代，每次接种

一次，再用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理PCV2病

毒繁殖的影响，再常规繁殖两代

病毒的效价。

PCV2病毒前均过滤

毒两代，为彻底消除Plasmocin对病

PCV2，最终快速、彻底清除了PCV2中污染的支原体，

毒效价仍可维持在10^7.3TCID50/ml以上。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

且PCV2的病

采用先过滤再用抗生素的方法，不仅节省了实验成本，更为重要的是抗生素使用次

数少，浓度小，去除支原体时间短，整个处理过程仅需8代，约

不会使PCV2病毒效价降低，可为疫苗生产提供

并为单位体积内疫苗半成品病毒含

16～20天可完成，且

无支原体且病毒效价高的PCV2病毒，

量的提高提供了保障。

附图说明

图1为1％琼脂糖凝胶电泳检测样品中支原体结果图。

图2为试验组样品、阳性对照、阴性对照IFA检测TCID₅₀测定结果图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

本发明提供的一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，具体步骤包括：

(1)0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代；

(2)PCV2病毒用终浓度2.5μ_g/ml的Plasmocin处理两代；

(3)常规繁殖PCV2两代。

所述步骤(1)具体包括下述步骤：

A、用含5％胎牛血清(PAA，A10209-1611)的MEM培养基(GIBCO，574131)培养

PK-15细胞，细胞密度为2×10⁵个/ml，将PCV2病毒用0.1μm

养基中接种PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为

种PCV2病毒的MEM培养基的细

培养

滤菌器过滤后，向MEM培

MEM培养基体积的1％，然后将装有接

胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，

72h；

B、将步骤A培养后的细胞瓶，进行冻融操作：将细胞瓶置于温度为-70℃的冰箱

中

C、再将细胞瓶进行步骤B的冻融操作两次，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶

D、将步骤A中的PCV2病毒替换成步骤C中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，再

所述步骤(2)具体包括下述步骤：

E、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵

个/ml，再向 MEM培养基中接种步骤(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒

积的1％，并向MEM培养基中加入

终浓度为2.5μg/ml，

37℃、

依次重复步骤A、步骤B、步骤C的处理3次，即制得PCV2病毒。

中冻融好的PCV2病毒悬液；

冷冻12h，然后再取出细胞瓶置于常温(15～25℃)中融化；

接种量为MEM培养基体

Plasmocin(Invivogen，MPT-34-01B)，使Plasmocin的

然后将装有接种了PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为

CO₂浓度为5％的培养箱中，培养72～96h；细胞铺满后，将细胞瓶反

复进行3次 步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬

液；

F、将步骤E中的PCV2病毒替换成步骤E中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重

所述步骤(3)具体包括下述步骤：

G、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵

个/ml，再向 MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒

积的1％，然后将装有接种了PCV2病毒的

复一次步骤E的操作，繁殖一代PCV2病毒。

接种量为MEM培养基体

MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，

培养72h；将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次步骤B中的

作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；

H、将步骤G中的PCV2病毒替换成步骤G中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重

为检测PCV2病毒中支原体的去除情况,对制备得到的PCV2病毒进行支原体鉴定，

具体方法为：参考猪支原体基因序列，Genbank登录号NR-103095.1，

件设计两对上下游引物P1：

复一次步骤G的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。

冻融操

用DNAMAN软

AAGTCGTAACAACCTATCCCTA，P2：GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA；

P3：GCAAGTCGATGAAGGACG，P4：GCTTCGCTCGCCACTACT,采用套

制得的PCV2病毒为模板，灭菌双蒸水为阴性对

P1和P2引物进行PCR扩增，将

段，将第二次PCR

式PCR法，以步骤H中

照，猪滑液囊支原体为阳性对照，先用

其扩增产物作为模板，再用P3和P4引物扩增基因片

扩增的产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测支原体。

为进一步检测PCV2病毒经处理后，其病毒效价是否受到影响，采用IFA法，即间

接免疫荧光法，对制备得到的PCV2病毒进行TCID₅₀测定，具

体方法为：

先将PK-15细胞用MEM培养基稀释成密度为2×10⁵个/ml的细胞悬液，

细胞悬液加 入到96孔细胞培养板中，100μl/孔，再将步骤H繁殖得到的

释，选择10^-2、10^{-PCV2病毒10倍系列梯度稀}

3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7

这6个梯度，100μl/孔加到细胞悬液中，每个 梯度重复6个孔，同时分别

设MEM培养基作阴性对照，10^7.3TCID₅₀/ml的PCV2病

毒作 阳性对照，阴性、阳性对照各1孔，然后将细胞培养板置于温度为

37℃、5％浓度CO₂的培养箱中，培养72h；

培养结束后，取出细胞培养板并弃掉细胞培养板中的液体，加入冷的甲醇-丙酮固

定液(按甲醇和丙酮体积比1:1配制)，100μl/孔，然后在-20℃冰箱固定30分

定液，再用pH为7.4的PBST洗涤1次细胞培养板，将细胞

钟，弃固

培养板甩干；

将鼠源Cap蛋白单克隆抗体用PBS进行1:2000倍稀释得到鼠源Cap蛋白单克隆抗

体稀释液，将鼠源Cap蛋白单克隆抗体稀释液按100μl/孔加入到甩干的细胞

然后将细胞培养板在37℃下摇床孵育60分钟，弃细胞培养板

的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；

培养板中，

中的液体，再用pH为7.4

将FITC-羊抗鼠二抗用PBS进行1:200倍稀释得到FITC-羊抗鼠二抗稀释液，将

FITC-羊抗鼠二抗稀释液按100μl/孔加入到甩干的细胞培养板中，锡箔纸包

吧避光，然后将细胞培养板在37℃下摇床孵育60分钟，弃细

pH为7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；

裹细胞培养

胞培养板中的液体，再用

将甩干的细胞培养板于倒置荧光显微镜下观察，按Reed和Muench法计算PCV2

下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式

限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方

病毒的效价。

法。

(1)0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代

用含5％胎牛血清的MEM培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵个/ml，

将PCV2病毒用 0.1μm滤菌器过滤后，向MEM培养基中接种PCV2病

培养基体积的1％，将接种PCV2毒，使PCV2病毒的接种量为MEM

的细胞瓶置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，

将培养后的细胞瓶取出，置于温度为-70℃的冰箱中冷冻12h，再将细胞瓶常温

(15～ 25℃)中融化，再将细胞瓶进行两次冻融操作，即共反复三次冻融操

融好的PCV2病毒悬液；

培养72h；

作，得到细胞瓶中冻

然后，将冻融好的PCV2病毒悬液作为接种种毒，采用步骤(1)中的方法处理3

(2)PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代

用含5％胎牛血清的MEM培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵个/ml，

向MEM培养基 中接种步骤(1)中制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种

并加入终浓度2.5μg/ml的Plasmocin，将

次，制得PCV2病毒；

量为与MEM培养基体积的1％，

接种PCV2的细胞瓶置于温度为37℃、CO₂浓度 为5％的培养

箱中培养，72～96h细胞铺满后，将细胞瓶按照步骤(1)的冻融操作，反

然后，将冻融好的PCV2病毒悬液作为接种病毒，再重复一次步骤(2)中的操作，

(3)常规繁殖PCV2两代

用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2×10⁵个

/ml，再向MEM 培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒

1％，然后将接种PCV2病毒的细胞瓶，

培养72h；将

制得PCV2病毒。

复3次冻融，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液。

接种量为MEM培养基体积的

置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，

细胞瓶反复进行3次冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；

将冻融好的PCV2病毒悬液作为接种病毒，重复一次步骤(3)的操作，继续繁殖

(4)支原体鉴定

为鉴定PCV2经处理后支原体的去除情况，用套式PCR法鉴定PCV2中的支原体,

将 步骤(3)中冻融好的PCV2病毒悬液为样品，将样品在沸水中煮沸5

离心10分钟，取上清作为PCR反应模板，并设猪滑液

水作阴性对照，按下述方法进行PCR扩

一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。

分钟，然后8000rpm

囊支原体作阳性对照，灭菌双蒸

增。

第一次循环：

扩增上游引物P1：AAGTCGTAACAACCTATCCCTA

下游引物P2：GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA

扩增体系：在PCR小管内依次加入：10×PCR buffer3μl,上游引物1μl，下游引物

反应程序：

第一步94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，68℃延伸1分钟，

将第一次循环的PCR产物，取1μl作为模板，进行第二次PCR循环，反应扩增体

系

第二次循环：

扩增上游引物P3：GCAAGTCGATGAAGGACG

下游引物P4：GCTTCGCTCGCCACTACT

反应程序94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，58℃退火30秒，68℃延伸30秒，

核酸电泳检测：用1％的琼脂糖凝胶电泳检测第二次PCR扩增的产物，结果出现

预期

具体可参考图1的电泳检测样品中支原体结果图，图中由左至右的5条光带，依次

是指：1、处理的PCV2；2、未处理的PCV2；3、阴性对照；4、阳性对照；

大小221bp的目的条带。

共30个循环；68℃延伸10分钟。

中各成分加入量与第一次循环相同。

共30个循环；68℃延伸10分钟。

1μl，dNTP2μl，TaqE1μl，模板1μl，补足灭菌双蒸水至30μl。

5、Marker

(2000bp)。

(5)PCV2TCID₅₀测定

先用MEM培养基将PK-15细胞稀释成密度为2×10⁵/ml的细胞悬液，

将细胞悬液 100μl/孔加入96孔细胞板中，再将步骤(3)中冻融好的PCV2

稀释，选择10^-2、10^-3、病毒悬液10倍系列梯度

10^-4、10^-5、10^-6、10^-7这6个梯

度，100μl/孔加入到细胞悬液中， 每个梯度重复6个孔，同时设MEM作阴

性对照、10^7.3TCID₅₀/ml的PCV2病毒作阳性对

照，阴性、阳性对照各1孔。37℃5％浓度的CO₂培养箱中培养

的液体，每孔加入100μl冷的甲醇-丙酮固定液

冰箱固定30分钟，弃固定液，用

隆抗体用

72h。弃掉细胞培养板中

(按甲醇与丙酮体积比1:1配制)，-20℃

pH7.4的PBST洗1次，自然晾干。将鼠源Cap蛋白单克

PBS进行1:2000倍稀释，稀释后的鼠源Cap蛋白单克隆抗体按100μl/孔加入到

晾干的培养板中，于37℃下摇床孵育60分钟。弃培养板中液体，PBST洗

FITC-羊抗鼠二抗用PBS1:200稀释后，稀释后的FITC-

甩干的细胞板中，锡箔纸包裹细胞培养板

培养板中液体，PBST洗涤

按Reed和

涤3次后甩干。

羊抗鼠二抗按100μl/孔加入上述

避光，并置37℃下摇床孵育60分钟。弃细胞

3次后甩干。将甩干的细胞培养板于倒置荧光显微镜下观察，

Muench法计算PCV2的病毒效价。

具体可参考图2的PCV2TCID₅₀病毒效价测定的IFA图片，其中图A、

B、C、D、E、 F依次为试验组样品稀释10^-2、10^-

3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7

的荧光测定图片；图G、H、I、 J、K、L依次为阳性对照稀释10^-

2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、

10^-7的荧光测定图片；M为阴 性对照的荧光测定图片(显

微镜放大倍率为10×10)。

(6)将PCV2病毒按MEM培养基1％的体积，接种密度为2×10⁵个/ml

的PK-15细胞悬 液，并将接种PCV2含MEM培养基的细胞瓶置于温度

培养72h，反复冻融

原体，

为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中

操作3次，并按此方法连续繁殖3代，琼脂糖凝胶电泳未检测到支

说明该方法已彻底去除了PCV2中污染的支原体，重复性好，为PCV2各种类型疫

最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于

以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明

导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范

苗的研制与开发提供了无支原体且效价高的病毒。

公开的内容中直接

围。