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第３５卷，第１２期 光谱学与光谱分析

２０１５年１２月 SpectroscopyandSpectralAnalysis

Vol.３５，No.１２，

pp

３３５０-３３５５

December，２０１５

红细胞携氧功能随孵育时间动态变化的研究

罗 曼

１*

，黄媛媛

１

，苏宝倡

２

，施云峰

３

，张 红

１

，叶迅达

１

１.暨南大学生物医学工程系，广东广州 ５１０６３２

２.暨南大学第一附属医院输血科，广东广州 ５１０６３０

３.暨南大学实验技术中心，广东广州 ５１０６３２

摘 要 血红蛋白氧合与脱氧的周期循环在体内驱动红细胞结构与功能调节中发挥着重要作用，已引起广

泛关注；但是对体外培养的红细胞在单个活态水平上进行携氧功能随孵育时间动态变化研究未见报道。本

研究应用显微激光共聚焦拉曼散射技术，采集不同时间的活态红细胞拉曼光谱，分析表征血红蛋白携氧能

力特征峰（１６３６和１５６２cm

-１

）和构象敏感的酰胺Ⅲ谱带（１２４０～１３００cm

-１

）随时间变化规律；同时结合扫

描电镜观察相应RBC形态。结果发现，在０～２４h内，结构稳定、变构协同功能正常的血红蛋白发生着携氧

量增加与减少和构象R态与T态交替变化，与此同时扫描电镜下双凹圆盘型红细胞也发生“伸长”与“收缩”

交替变化。本结论不仅为体外研究红细胞携氧功能提供来自单个活细胞内的多水平特征参数，同时也为体

外开展针对红细胞筛选活性组分、评价药物药效和毒副作用研究开拓思路。

关键词 红细胞；血红蛋白；携氧功能；拉曼光谱；SEM

中图分类号：Q２１ 文献标识码：A DOI：１０.３９６４／

j

.issn.１０００-０５９３（２０１５）１２-３３５０-０６

摄入调节等。鉴于上述，对红细胞携氧能力及其动态变化研

引 言

红细胞（redbloodcells，RBC）主要功能是为组织代谢运

输氧、二氧化碳等，并为维持体内稳态发挥重要作用。红细

胞主要成分是占总蛋白９５％血红蛋白（hemoglobin，Hb）。

１９５９年，Perutz用X射线衍射获得血红蛋白的三维结构

［１］

，

血红蛋白是α和

β

亚基组成的四聚体（α

２

β

２

），９８％以脱氧态

（tense，T态）和氧合态（relax，R态）二种构象存在。T态构

象紧缩，受亚基间束缚限制多，与氧亲和力弱；而R态受限

制少相对松弛，与氧亲和力强。功能正常血红蛋白与氧配体

作用具有正协同性，即O

２

与Hb一个结合位点作用能增加

其余位点与氧的亲和性，从而启动整个蛋白分子从T-型转化

成R-型；同样，O

２

从Hb一个结合位点释放，增加其余位点

氧释放能力，则启动整个蛋白分子从R-型转化成T-型。血红

蛋白从结合氧到释放氧循环，其变构效应本质就是Hb二种

构象R态与T态的循环。大量研究结果表明，在体内血红蛋

白的氧合与脱氧循环调控着一系列时间依赖性的重要细胞活

动

［２］

究不仅是对红细胞基本功能状况的了解，同时也是对相关调

控事件是否有序进行的初步判断。因此，开展对体外培养的

单个红细胞，进行携氧能力动态变化的无扰研究具有十分重

要的意义。

目前体外检测红细胞携氧能力常用的方法主要是检测氧

分压、

p

H值、血氧饱和度的变化以及采用同位素标记、血氧

分析仪等方法

［３-５］

，但它们在研究对象、方法和结果方面分

别存在群体、有扰和间接的局限性，因此不能反映自然培养

条件下，来自单个红细胞内携氧量的真实变化。虽然实时、

无扰的显微激光共聚焦拉曼技术已经广泛应用于红细胞功能

和血红蛋白构象变化的研究

［６-９］

，但对单个活态红细胞携氧

功能随孵育时间动态变化的研究尚未见报道。研究运用显微

激光共聚焦拉曼光谱系统采集不同孵育时间的单个红细胞拉

曼光谱，通过分析血红蛋白携氧能力特征峰（１６３６和１５６２

同时结合扫描电镜技术观察RBC形态特征，揭示它们随时

cm

-１

）和蛋白构象敏感的酰胺Ⅲ谱带（１２４０～１３００cm

-１

），

，如受控于“T-Hb与带３蛋白结合”的糖酵解调节、高

间变化规律及其相关性。本研究旨在为体外评价红细胞携氧

功能及相关事件，提供来自单个活细胞的多水平特征参数，

同时也为体外开展针对红细胞筛选活性组分、评价药物药效度依赖R-Hb浓度的膜粘弹性调节、伴随放氧对NO释放与

收稿日期：２０１４-０９-２６，修订日期：２０１４-１２-２２

基金项目：国家自然科学基金项目（３０９７３１５８）和广东省教育部产学研结合项目（２０１０B０９０４００１８２）资助

作者简介：罗 曼，女，１９６３年生，暨南大学生物医学工程系教授 e-mail：txionglu＠

j

*通讯联系人 e-mail：txionglu＠

j

第１２期 光谱学与光谱分析

和毒副作用研究开拓思路。

３３５１

示不同孵育时间血红蛋白侧链酪氨酸残基的拉曼特征谱线变

化。

Table1 Intensitychangesofspectralpeaksbelongedtothehe-

moglobintyrosineresiduesinRamancharacteristic

spectrumsunderdifferentincubationtime

孵育时间

４h

８h

I

８５０cm

-１

３.１７

２.５０

I

８３０cm

-１

８.６５

１１.６４

I

８５０cm

-１

／

I

８３０cm

-１

０.３７

０.２１

蛋白质稳定性

评估

Stability

Stability

１ 实验部分

1.1 试剂

RMPI１６４０粉末（Gibco，USA），胎牛血清（杭州四季青

生物制品有限公司），青霉素、链霉素（华北制药厂），无菌生

理盐水，戊二醛（AR，天津市大茂化学试剂厂），无水乙醇

（AR，广州化学试剂厂）。

1.2 仪器

JY

５５）

公司

激光显微共聚焦拉曼光谱仪

，倒置显微镜

），场发射扫描电子显微镜

（LabRAM

（尼康公司），超净台

（

（

FESEM

INV

苏州净化设备有限公

ZEISS

型，Horiba

Ultra-

司），恒温CO

２

培养箱（Thermo公司）。

1.3 方法

１.３.１ 红细胞悬液的制备及样品的处理

新鲜血液由健康志愿者提供；血液样品中红细胞经离心

（１５００r・min

-１

，５min；含３次无菌生理盐水洗涤）后获得，

再加入含１０％胎牛血清和１％双抗的RMPI１６４０培养基制

得红细胞悬液（１.０×１０

６

mL

-１

）；置于３７℃的CO

２

培养箱中

孵育。

１.３.２ 拉曼光谱的检测

用显微激光拉曼共聚焦拉曼光谱扫描检测仪分别对孵育

红细胞连续在４，８，１６和２４h进行光谱采集。该系统使用奥

林巴斯倒置显微镜，配置的激光器为氦-氖激光器，其激发光

波长为６３２.８nm。扫描前利用标准硅片位于５２０.７０cm

-１

谱

带进行波数轴和激光功率校准。实验时使用６０倍物镜，选细

胞中心和上下左右４个不同近膜部位进行线扫描拉曼谱采

集，采集光谱范围为４００～４０００cm

-１

，样品扫描曝光时间为

１０s，循环２次，并且选择细胞外一点进行背景拉曼光谱采

集。每组样品采集的拉曼谱至少来自５个细胞。

１.３.３ 拉曼谱线处理

将扫描所得的拉曼光谱减去背景谱线后进行分类。将分

类后的各组谱线进行平均处理，用LabSpec５软件将平均后

的各谱线以最大强度峰为１００做标一化（Normalise）处理，为

了去除荧光背景，再进行基线校正（baseline）。将所得的光谱

数据输入到Origin７.５软件进行数据处理，绘制不同样本的

红细胞拉曼谱线。

１.３.４ 扫描电镜样品的制备及观察

按照１.３.１的方法制备红细胞样品，将孵育后的样品取

出

min

，先用倒置显微镜拍摄细胞形态，然后离心（１５００r・

-１

，５min）去上清。根据文献［１０］所描述的方法进行预处

理，经２.５％戊二醛固定、梯度酒精脱水后，将样品加入适量

无水乙醇混匀后滴于盖玻片上，于室温自然干燥后置离子溅

射仪中镀金，最后进行扫描电镜观察。

２ 结果与讨论

2.1 体外培养的红细胞

红细胞血红蛋白结构稳定，但构象发生微小波动表１表

１６h１.１４６.８３０.１７Stability

２４h２.０８７.０２０.３０Stability

蛋白质酪氨酸残基对羟苯基环在８５０和８３０cm

-１

的拉

曼双峰谱线被认为是对侧链微环境变化非常敏感的构象灵敏

谱线

［１１］

，当I

８５０

／I

８３０

≥１时，说明酪氨酸呈现“暴露”构象，

提示蛋白质结构不稳定并且发生较大幅度变化；当I

８５０

／I

８３０

＜１时，表明酪氨酸呈“埋藏”构象。表１示意不同时间组血

红蛋白酪氨酸残基特征谱线的强度，从表中可以看出各组

I

８５０

／I

８３０

比值都小于１，提示随时间变化红细胞内血红蛋白结

构稳定，没有发生变性。值得注意的是，不同孵育时间组的

I

８５０

／I

８３０

比值间均有较小幅度差异，说明随孵育时间延长，血

红蛋白构象发生微小变化。

2.2 体外培养的红细胞携氧能力呈现增减交替变化

红细胞拉曼谱中几乎所有谱峰与血红素分子键振动之间

的相关性都已经得到确认

［１３，１４］

。血红素分子键振动依赖于

血红素构象，而后者又受配体（O

２

，CO，orNO）、Fe

２＋

与血

红素环的位置以及血红蛋白构象的影响。根据Wood等研究

报道

［１２］

，６３２.８nm激发波长下，氧合红细胞拉曼谱中有５

条重要特征谱线：１６３６cm

-１

谱线是氧配体结合时特有的，

并且峰强大小与携氧量呈正相关

构象有关，其峰强变化与１

１

６３６

；１

６３６

cm

５６２cm

-１

Hb

谱线主要与

-１

一致时，说明Hb变

构功能正常；在此前提下，当cm

-１

谱线增强说明红细

胞携氧能力提高

中Fe

，相反表明携氧能力下降；１３６７cm

-１

Hb

表征

２＋

的氧化能力；双峰１２４８和１２２３cm

-１

，前者仅

出现在R-Hb（R态血红蛋白）中，而后者在R-Hb和T-Hb（T

态血红蛋白）中都存在。图１中来自４个时间组的拉曼谱（１，

２，３，４）与文献［１２，１５-１６］中报道的正常人红细胞拉曼谱非常

相似。因此，可判断来自体外不同孵育时间的红细胞拉曼谱均

属于典型氧合红细胞型，这说明暴露于空气环境下的红细胞

如同体内肺动脉中的红细胞一样，R-Hb总量比T-Hb多。

从图２可看出随孵育时间推移，１６３６和１５６２cm

-１

谱

线峰强变化呈现高度一致性即同向性交替增减，此外，在

１３６７cm

-１

峰强和双峰比值（I

１２２３

／I

１２４８

）变化中也呈现类似

趋势。这提示在体外培养条件下，随着时间的推移，红细胞

携氧能力呈现增减交替变化，同时暗示红细胞内部分血红蛋

白构象发生R态与T态交替转化。

进入RBC中葡萄糖经糖酵解（EMP）和磷酸戊糖（PPP）

二条途径进行分解代谢。EMP途径主要是完成细胞对ATP

和２，３-DPG产物的需求，其中２，３-DPG具有促进脱氧作