2024年2月22日发(作者：飞利浦剃须刀series1000)

桑树原生质体分离条件的优化

高丽霞;蒋冬梅

【摘 要】The factors affecting mulberry protoplast isolation were studied

by the enzyme hydrolysis and hemacytometer methods to optimize the

mulberry protoplast isolation condition and to provide the theoretical

basis for mulberry protoplast fusion, new germplasm and plant genetic

improvement. The results showed that enzyme type, different enzyme

combination, enzymolysis time and osmotic pressure had significant effect

on mulberry protoplast isolation. The higher mulberry protoplast yield

could be obtained under the optimum condition including 1.0% cellulase,

0. 5% pectolase, 0. 2% macerozyme, 0. 6 mol/L mannitol, CPW, and 28 "C

+2 °C for 6 h.%为了获得桑树原生质体分离的最优条件,为今后桑树原生质体融合、新种质的获取等植物遗传改良提供理论基础,采用酶解法和血球板计数法,对桑树原生质体分离的影响因素进行研究.结果表明,酶、酶液组合、酶解时间和渗透压稳定剂等都对原生质体的制备有显著的影响,较适宜桑树叶片游离的组合条件是1.0％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.2％离析酶+0.6 mol/L甘露醇+CPW盐溶液,酶解温度为28℃±2℃,酶解时间为6h.在此条件下可获得高产量的原生质体.

【期刊名称】《贵州农业科学》

【年(卷),期】2012(040)002

【总页数】3页(P20-22)

【关键词】桑树;原生质体;分离

【作 者】高丽霞;蒋冬梅

【作者单位】河池学院,广西宜州546300;河池学院,广西宜州546300

【正文语种】中 文

【中图分类】S888.302

桑是桑科（Moraceae）桑属（Morus）落叶乔木，是重要的多年生木本经济作物，是发展蚕业生产的重要物质基础。随着广西蚕业规模不断扩大，桑叶产量及桑树的病虫害已成为蚕业稳步发展的重要制约因素。因此，选育优良的桑树品种显得尤为重要。通过育种手段，选育高产、抗病的桑树新品种是可行也是必要的。利用原生质体进行体细胞杂交被认为是引进野生种质、克服受精不育性障碍，从而获得有益杂交组合的最有效方法，可创造不同物种间的杂交后代，培育出新的育种种质资源[1]。有关优良原生质体制备方法的研究已有大量文献报道，其研究材料多选取无菌苗叶片或愈伤组织，也有的直接用叶片进行原生质体分离，而对影响因素的研究多集中在酶类组合、酶解时间、甘露醇的含量及酶解温度等几个方面。蔡肖等[2]以小青杨无菌苗叶片为材料进行原生质体分离条件的研究，得出酶的种类和浓度、渗透压稳定剂浓度、酶解时间及叶龄是影响原生质体分离的重要因素。岳超君等[3]利用黑果腺肋花楸的愈伤组织在20g／L纤维素酶＋0.5g／L果胶酶＋13%甘露醇＋5mmol／L MES酶解液中，在黑暗条件下静置酶解10h，从而获得高产量高活力的原生质体。王丽爽等[4]采用子粒饱满的红麻种子诱导愈伤组织，以继代5～10d质地疏松的白色愈伤组织为材料，研究了水解酶的组合、酶解时间、渗透压（甘露醇）和酶解液pH值等影响因素对红麻原生质体分离制备效果的影响。陈泽雄等[5]以红叶石楠（Photinia×frasery）叶片为试验材料，研究了预处理时间、酶类组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量及酶解温度等不同因素对其原生质体分离

的影响。廖嘉明等[6]以野生型拟南芥无菌苗为材料，研究了叶肉原生质体分离过程中的预处理条件、酶解方式、酶解温度和离心力大小等因素对产量和活力的影响。桑原生质体分离的研究始于80年代初的日本，大山胜夫等分别从酶解液成分、渗透压、材料种类、分离条件等方面对桑树原生质体的分离进行了研究。近年来，我国在这方面也进行了大量的研究。陈爱玉等[7]对桑树原生质体分离技术进行研究发现，在适宜酶溶液浓度下，桑原生质体的释放速度和产量顺序为桑子叶＞幼叶＞悬浮培养细胞＞愈伤组织，酶液最适渗透剂浓度为0.5～0.6M的甘露醇。经预培养处理的材料，原生质体产量比对照提高12.9倍。倪国孚等[8]对桑原生质体产量与酶解时间和纤维素酶用量的关系进行了研究。在桑树原生质体分离的研究中，前人没有系统地将酶种类、浓度、渗透剂及酶解时间进行综合研究，而这几方面是影响原生质体分离的最重要的因素，且酶液成分也往往局限于纤维素酶和果胶酶。为此，笔者从不同酶液组合、酶液浓度、渗透势和酶解时间等方面对原生质体分离条件进行研究，以期得到桑树原生质体分离的最优条件，并为今后桑树原生质体融合、新种质的获取奠定理论基础。

1.1.1 外植体 供试的外植体材料为河池学院东校区桑园中自然生长状态下生长旺盛的果桑和桂桑优2号的幼嫩叶片。

1.1.2 主要试剂 甘露醇、纤维素酶（Cellulase）、果胶酶（Pectolyase）、离析酶（Macerozyme R-10）等均来自于上海生工生物技术有限公司；细胞－原生质体清洗液（CPW溶液）；为保持分离原生质体过程中的高渗状态，在CPW溶液中加入了不同浓度的甘露醇[9]。

1.1.3 仪器设备 BSA223S型精密电子天平〔赛多利斯科学仪器（北京）有限公司〕，冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），CS101-AB型电热鼓风干燥箱（重庆实验设备厂），奥林巴斯生物显微镜CX21（日本）。

1.2.1 原生质体的分离 原生质体分离采用酶解法[10]。

1.2.2 不同酶液组成对分离原生质体的影响 分别用4种不同的酶液组合（表1）处理桑叶，以测定其对原生质体分离的影响。

1.2.3 不同酶液配比对分离原生质体的影响 在1.2.2试验的基础上，采用不同的酶液浓度配比处理桑叶，以测定其对原生质体分离的影响。

1.2.4 渗透压对分离原生质体的影响 在1.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.2%离析酶组合的情况下，分 别 用 0.4mol／L、0.5mol／L、0.6mol／L、0.7mol／L的甘露醇调节渗透压，测定不同渗透压下原生质体分离及活力情况。

1.2.5 酶解时间对分离原生质体的影响 28℃下震荡酶解，2h后取样镜检，之后每隔2h取样测定原生质体的产量[10]。

1.2.6 原生质体产量的测定方法 取少量原生质体悬浮液滴加在血球计数板上，当原生质体充满计数室后，在显微镜下计数，计算4个角和中央大格内的原生质体数，每个样品取3～5次重复值的平均数[11]，计算公式如下：

原生质体数（个／mL）＝5个大格内原生质体总数÷5（每个大格平均原生质体数）×10 000（每个大格溶液体积为0.1mm3）×稀释倍数

原生质体产量（个／g）＝原生质体数（个／mL）×稀释后体积（mL）÷细胞总重（g）

从表1可见，1）E1处理得到的原生质体数量要比E2处理和E3处理高3～4倍，说明，纤维素酶是桑树原生质体分离主要的酶种；2）E4处理得到的原生质体数比E1处理高得多，说明，果胶酶对原生质体的分离很关键。所以，在分离桑原生质体时采用的酶液组合为纤维素酶＋果胶酶＋离析酶。

酶解条件是影响原生质体游离的最重要的因素，主要降解构成植物细胞壁的纤维素、半纤维素和果胶质。研究酶解处理的目的就是要用最低的酶浓度和在最短的酶解时间内获得大量有活力的原生质体[12]。根据1.2.2的试验结果确定不同的酶液浓度（表2）可知，1.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.2%离析酶比较适合桑原生质体的

分离。

从表3可见，原生质体产量随着甘露醇浓度的升高而增大，当甘露醇浓度为0.6mol／L时，原生质体产量达最高；当甘露醇浓度超过0.6mol／L时，原生质体产量反而呈下降趋势。因此，桑叶原生质体游离时，0.6mol／L的甘露醇浓度较为适宜。

从图示可见，酶解2h后，有少量原生质体释放出来，但是个体比较小；4h后，大量的原生质体开始释放；6h原生质体产量达最高峰；之后原生质体产量开始下降。随着酶解时间的延长，原生质体的产量反而下降。

桑幼叶取材容易，是分离原生质体的好材料。在适宜的酶溶液中，酶解4～8h，就可获得大量的、稳定性好的原生质体。桑树是多年生叶用木本植物，无论是实生苗还是成年树，其叶片一般都不易去除下表皮。因此，在原生质体研究中，选择适当的组织材料和适宜的酶制剂种类与浓度，是获得高产量、活力强的原生质体的关键。本研究通过比较不同酶液组合、酶液浓度、渗透势和酶解时间对原生质体产量的影响，得出以下结论，对桑树叶片原生质体分离具有一定的参考价值。

1）1.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.2%离析酶的组合对于分离桑原生质体的效果最好。在原生质体分离过程中，不同种类的酶及其浓度对原生质体产量和活力都有较大影响。纤维素酶是酶解的关键酶，适当的酶液浓度对于分离得到大量活力强的原生质体是十分关键的。作者研究发现，当纤维素酶浓度提高后（A4处理），原生质体的产量反而下降，这可能是随着酶液浓度的加大，部分原生质体发生了破裂和自发融合[13]所致。有研究表明，纤维素酶浓度不是越大越好，浓度过高对原生质体毒害作用越强，而且不易洗净[14]。另外，果胶酶对桑原生质体的分离也是不可缺少的，其浓度的调节直接关系到原生质体产量的多少。

2）在分离桑原生质体过程中，选择合适的渗透稳定剂对提高原生质体产量和质量很重要。甘露醇浓度低，原生质体易于破碎；浓度高，原生质膜收缩，对原生质体

以后的培养和融合的利用均不利[8]。

3）酶解时间的长短是影响桑原生质体产量的重要因素，当酶液浓度配比一定时，28℃震荡酶解调节下，桑叶随着酶解时间的延长，其原生质体的产量也不断增加。酶解6h时，原生质体产量最高。由于6h后形成的原生质体如果继续酶解，则会导致原生质体的细胞膜发生破裂，导致原生质体数产量下降，因此，酶解4～8h为最佳。

4）分离的原生质体很容易破碎，在操作过程中要非常小心，并保持稳定渗透压。酶液中适当提高Ca2＋浓度可提高质膜的稳定性，增加完整原生质体的数量[15]。

【相关文献】

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[2]蔡 肖，康向阳.小青杨叶肉原生质体分离条件的研究[J].中国农学通报，2011，27（10）：18-22.

[3]岳超君，张志东，吴 林，等.黑果腺肋花楸原生质体分离研究[J].吉林农业大学学报，2010，32（6）：639-643，649.

[4]王丽爽，张宗申，郑来久.红麻原生质体分离条件的优化[J].大连工业大学学报，2010，29（4）：244-247.

[5]陈泽雄，刘奕清，黄登艳.红叶石楠叶片原生质体分离条件的研究[J].湖北农业科学，2010，49（6）：1401-1403.

[6]廖嘉明，王伯初，王益川，等.拟南芥叶肉原生质体分离条件的优化研究[J].西北植物学报，2010（6）：1271-1276.

[7]陈爱玉，王 勇，倪国孚.桑树原生质体分离技术的研究[J].蚕业科学，1994，20（3）：141-144.

[8]倪国孚，陈爱玉.桑原生质体产量与酶解时间和纤维素酶用量关系的调查[J].蚕业科学，1989，15（3）：156-157.

[9]张 颖，张微微，王 芳.植物原生质体研究概况[J].安徽农业科学，2010，38（8）：3941-3943.

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type rice and CMS rice[J].Plant cell report，1989，8：329-332.