2023年12月10日发(作者：红米note3充电器参数)

胶束电动毛细管色谱法检测红曲米中的莫纳可林K

张良;许杨;李燕萍

【摘 要】建立了测定红曲米中莫纳可林K含量的胶束电动毛细管色谱(MEKC)方法.考察了运行缓冲液的种类、pH及其浓度、有机添加剂、十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度和分离电压等实验条件对电泳分离效果及检测灵敏度的影响.在优化的实验条件下,以20 mmol/L 硼砂(pH 10.6,含10%(体积分数)乙醇和40 mmol/L SDS)作为缓冲溶液,莫纳可林K能在23 min内实现很好的基线分离,线性范围为5.00～100.00 mg/L,线性相关系数为 0.9976,检出限(以信噪比(S/N)为3计)为0.13

mg/L,加标回收率为98.5% ～99.5%.精密度和稳定性试验中,峰面积和迁移时间的相对标准偏差均小于3%,表明重复性良好.该方法简便、快速、灵敏,可用于红曲米中莫纳可林K含量的测定.

【期刊名称】《色谱》

【年(卷),期】2010(028)004

【总页数】4页(P393-396)

【关键词】胶束电动毛细管色谱;莫纳可林K;红曲米

【作 者】张良;许杨;李燕萍

【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室中德联合研究院,江西,南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室中德联合研究院,江西,南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室中德联合研究院,江西,南昌,330047 【正文语种】中 文

【中图分类】O658

莫纳可林 K(M onacolin K,或称洛伐他汀、Lovastatin)是上世纪 70年代由日本学者 Endo等和欧洲学者分别从红曲霉和土曲霉发酵产物中得到的,它能有效抑制胆固醇生物合成中的关键酶 HMGCoA(3-羟基-3-甲基-戊二酰基-辅酶 A还原酶)的活性,从而调节人体内异常的血脂水平[1]。莫纳可林 K存在酸式和内酯式两种形态(如图1所示)[2],本文主要检测红曲米中内酯式莫纳可林 K。

目前,国内外报道的检测莫纳可林 K的方法主要有高效液相色谱法 (HPLC)、紫外分光光度法(UV)、薄层色谱法 (TLC)等[3-7]。UV和 TLC方法操作繁琐、检测灵敏度都较低;HPLC的检测灵敏度可达 0.2m g/L[7],但该法检测时色素对莫纳可林 K的分离有干扰,且存在有机溶剂使用多、易造成环境污染、样品用量大等缺点。毛细管电泳(CE)作为一种高效分离分析方法,具有分析速度快、分离效率高、环保、样品用量少等优点[8],特别是其中的胶束电动毛细管色谱法 (M EKC),即可分析带电物质又可分析中性物质,独特的优势使其在药物和天然产物分析中得到了广泛的应用[9,10]。尽管 CE用于莫纳可林 K的分离也有一些报道[2,11-14],但都是采用毛细管区带电泳法 (CZE)。本文采用新的缓冲体系(硼砂-乙醇体系)作为背景电解质的M EKC分离模式,对固态发酵红曲米中的莫纳可林 K进行了检测,达到了较好的检测灵敏度。该法可以解决HPLC检测红曲米样品中莫纳可林 K时色素对其干扰的问题,可用于发酵红曲米中莫纳可林 K的质量控制。

图1 (a)酸式和(b)内酯式莫纳可林 K的结构式F ig.1 S tructu ra l form u lae

of(a)acid and (b)lactone of M onaco lin K

1 实验部分 1.1 仪器与试剂

Beckm an高效毛细管电泳仪 (美国 B eckm an Coulter公司);熔融石英毛细管柱

(河北省永年锐沣色谱器件有限公司);PHS23C型酸度计(上海雷磁仪器厂);3K18冷冻离心机 (美国 Sigm a公司); Kotterm ann恒温水浴锅 (德国 Kotterm ann公司); 2.5L超声波清洗设备 (英国 Edisafe公司),ELGA超纯水仪(ELGA公司)。

莫纳可林 K标准品(美国 Sigm a公司);红曲米(红曲菌固态发酵大米而得);乙酸甲酯、硼砂、十二烷基硫酸钠 (SDS)、甲醇、乙醇、二甲基亚砜 (DMSO)均为分析纯;实验所用水为超纯水。

1.2 标准品溶液和样品溶液的制备

标准品溶液:精密称取莫纳可林 K标准品 25 m g,用 5mL无水乙醇溶解,即得质量浓度为 5g/L的标准品溶液,置于4℃冰箱中保存,使用时稀释成各种浓度的标准溶液。

样品溶液的制备:精密称取 0.3g红曲米粉末,置于 10mL离心管中,加入 4mL乙酸甲酯,超声(功率 250W,频率 40kHz)处理 20m in,离心(5 000r/m in)6m in,取上清液于另一 10mL离心管中;沉淀残渣再重复提取一次;合并两次提取的上清液。将上清液置于60℃水浴中蒸干,残渣用 2mL无水乙醇复溶,经0.45μm有机膜过滤,滤液备用。

1.3 实验方法

电泳运行缓冲液为 20mm ol/L硼砂溶液,含10%(体积分数,下同)乙醇和 40mm

ol/L SDS,用 1 m ol/L N aOH溶液调节 pH至 10.6;石英毛细管(60.2cm×75μm,有效长度为 50cm);紫外检测波长为 237nm;分离电压为 20kV;分离温度为 25℃。实验前将缓冲液用 0.45μm滤膜过滤并超声波脱气 5m in。新的毛细管使用前以

1m ol/L N aOH溶液冲洗 60m in。每次实验前分别用 0.1 m ol/L N aOH溶液、超纯水、缓冲溶液冲洗 10m in。重复进样时只用缓冲溶液冲洗 2m in。更换不同缓冲溶液时按上述步骤重新处理。

2 结果与讨论

2.1 电泳条件的优化

2.1.1 运行缓冲液种类、浓度和 pH值的选择

考察了不同浓度的甘氨酸缓冲体系和硼砂缓冲体系对分离效果的影响。结果发现:虽然甘氨酸缓冲体系相对于硼砂缓冲体系的运行电流要低,但硼砂体系的分离度和灵敏度都相对较高,所以本文选择硼砂电泳缓冲体系。进一步考察了硼砂的浓度为5～50mm ol/L时对分离度和分离电流的影响。结果表明:随着硼砂浓度的增加,电泳工作电流逐渐增大,硼砂浓度为 40mm ol/L时已达到电泳允许最大工作电流

100μA;硼砂浓度小于 10mm ol/L时,分离度较小;当硼砂浓度为 20mm ol/L时,电泳分离度达到最大值。综合考虑,本文选择硼砂浓度为 20 mm ol/L。

在硼砂缓冲液浓度为 20mm ol/L时,对 pH从9.8至 12.6每隔 0.4个单位进行考察。结果发现:随着 pH的增大,工作电流逐渐增大,目标峰峰高呈先增加后降低的趋势,缓冲体系的 pH为 10.6时峰高值达最大(见图2)。由于电流大不利于后续的电泳分离条件的优化,而目标峰峰高过低则会影响检测的灵敏度。综合以上因素,本文选择 pH为 10.6的硼砂缓冲体系。

2.1.2 有机添加剂对分离检测的影响

图2 硼砂缓冲体系pH对莫纳可林 K电流和峰高的影响F ig.2 Effects of pH of

bo rax buffe r on cu rren t and p eak he ight of M onaco lin

KConditions:fused-silica cap illary,60.2cm (effective length,

50cm)×75μm;running buffer,20mm ol/L borax-NaOH;app lied

voltage,20kV;cap illary temperature,25℃;injection, 3448Pa×10s.

电泳分离过程中,有机添加剂的加入可以改进介质的黏度、介电常数、双电层结构等,进而影响电渗流的大小,从而达到调节选择性、改进分离度的目的。实验中考察了甲醇、乙醇、DMSO等 3种有机添加剂及其不同含量时对分离效果的影响。结果表明:以乙醇为有机添加剂时的目标峰较高(见图3),有利于分析检测的灵敏度,所以本文选择乙醇作为有机添加剂。进一步考察了乙醇含量对分离的影响。随着乙醇添加比例的增加,目标物的迁移时间逐渐延长;乙醇含量为 10%(体积分数)时,目标峰的检测灵敏度达到最大,故本文选择 10%的乙醇作为有机添加剂进行下一步条件的优化。

图3 有机添加剂对莫纳可林 K峰高和迁移时间的影响F ig.3 Effects of o rgan ic

add itives on p eak he igh t and m igra tion tim e of M onacolin

KConditions:running buffer,20mm ol/L borax-NaOH buffer

(pH10.6)containing different organic additives.O ther conditions are the

sam e as in Fig.2.

2.1.3 SDS浓度的选择

当缓冲溶液中的 SDS浓度超过其临界胶束浓度(CMC)8.2mm ol/L时,SDS分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束 (假定固定相),溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离[7]。本实验考察了不同浓度 (5,10,15,20,25,30,

35,40,45,50mm ol/L)的 SDS对分离效果的影响,结果见图4。从图4可看出随着

SDS浓度的增加,目标峰迁移时间逐渐延长,峰高在 SDS浓度为10mm ol/L时出现拐点后先增大后降低。当 SDS浓度为 40mm ol/L时,目标物的峰高达到最大,检测灵敏度最好。综合分析速度和灵敏度等因素,本文选择 SDS浓度为 40mm ol/L。

图4 SDS浓度对莫纳可林 K迁移时间和峰高的影响F ig.4 Effects of SDS concen

tra tion on m igra tion tim e and peak he igh t of M onaco lin

KConditions:running buffer,20mm ol/L borax-NaOH buffer

(pH10.6)containing different concentrations of SDS and10% (v/v)ethanol.O

ther conditions are the sam e as in Fig.2. 2.1.4 分离电压的选择

考察了外加分离电压 (11,14,17,20,23,26, 29kV)对溶质分离效果的影响。结果表明:随着分离电压的增大,焦耳热逐渐增大,进而使背景噪声增加;同时又会导致迁移时间也逐渐减小,这又利于样品的快速分析。综合考虑,选择 20kV作为电泳分离电压。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系

吸取莫纳可林 K标准品溶液并用无水乙醇分别稀释至 5,10,20,30,40,60,100m g/L的系列质量浓度,在上述电泳条件下进样测定。以峰面积(Y)对样品质量浓度 (X,m

g/L)做标准曲线,得到线性回归方程为 Y=4 316.5X+8 323.4(r= 0.997 6)。结果表明,莫纳可林 K在 5～100m g/L范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度

对同一样品溶液连续进样 6次,在优化的电泳条件下测定,峰面积的相对标准偏差

(RSD)为2.14%,迁移时间的 RSD为 0.04%,结果表明精密度良好。

2.2.3 稳定性

取新制备的同一样品溶液,分别于 0,2,4,8, 10,16h进样测定其峰面积和迁移时间,峰面积的RSD为 1.49%,迁移时间的 RSD为 1.65%,表明稳定性良好。

2.2.4 重复性与检出限

精密称取同批次样品,按照 1.2节方法分别制备 6份样品溶液,在优化的电泳条件下测定,峰面积的RSD为 1.35%,迁移时间的 RSD为 0.53%。以信噪比(S/N)为 3时相应的质量浓度为方法的检出限,其值为 0.13m g/L。

2.3 样品测定及回收率

用本方法对本实验室固态发酵的红曲米进行测定,在上述优化的实验条件下测定 3次,计算出莫纳可林 K的平均含量为 151.6μg/g。在优化的电泳条件下莫纳可林 K标准品和红曲米样品的电泳图谱见图5。 图5 (a)莫纳可林 K标准品溶液(10m g/L)和(b)红曲米样品的胶束电动毛细管色谱图F ig.5 M EKC e lectrophe rogram s of(a)M onacolin K standa rd so lu

tion(10m g/L)and(b)red fe rm en ted riceConditions:running buffer,20mm

ol/L borax-NaOH buffer (pH10.6)containing40mm ol/L SDS

and10%(v/v)ethanol. O ther conditions are the sam e as in Fig.2.＊Monacolin K.

精密称取已知莫纳可林 K含量的红曲米样品 9份,每份 0.30g,分别精密加入一定量的标准品。每个样品按 1.2节的样品制备方法平行制备 3份,在优化的电泳条件下进行检测,计算得到的回收率结果见表1。

表1 红曲米中莫纳可林 K的回收率(n=3)Tab le1 Recove ry of M onaco lin K in

red fe rm en ted rice(n=3)?

3 结论

本文通过优化运行缓冲液体系的组成和分离条件,建立了一种基于胶束电动毛细管色谱法检测红曲米中莫纳可林 K的方法。该方法既完全克服了HPLC方法中色素对测定的干扰问题,又解决了由于红曲米样品中莫纳可林 K含量低而检测困难的问题。同时还具有进样量少、测定快速、灵敏度高、环保等显著特点,适用于固态发酵红曲米中的莫纳可林 K的定量和定性分析。

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