2024年3月5日发(作者：)

技术创新TechnologyInnovationandApplication科技创新与应用2020年13期BioID技术在肿瘤蛋白质组学中的发展与应用王晓飞，丁明*（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009）摘要：蛋白质通过形成复合物或蛋白-蛋白相互作用来执行生物学功能，蛋白-蛋白相互作用是细胞生命活动的基础，也是整个生物学领域研究的核心问题之一。传统的互作蛋白筛选方法包括酵母双杂交和串联亲和纯化等，但这些方法具有一定的局限性，很难适用于实时和动态蛋白相互作用分析。邻近依赖生物素鉴定（BioID，proximity-dependentbiotinidentification）是筛选活细胞中发生的蛋白相互作用的独特方法，利用修饰过的生物素连接酶BirA与感兴趣的蛋白融合表达，生物素化近端内源蛋白质，生物素化的蛋白可以被选择性分离并用生物质谱鉴定出目标蛋白的候选相互作用物。BioID已成功应用于不溶性蛋白及瞬时或弱相互作用蛋白的研究，也逐渐应用于肿瘤等疾病发生机制及药物靶点筛选的研究。文章针对该技术进行了详细总结，并讨论了其在肿瘤蛋白质组学中的应用。蛋白-蛋白相互作用关键词：BioID；邻近蛋白标记；中图分类号院O629.73文献标志码院A文章编号院2095-2945渊2020冤13-0164-04Abstract:Proteinsperformbion-proteininteractionisnotonlythebasisofcelllifeactivities,ionalproteity-dependehefusionexpressionofmodifiedbiotinligaseBirAwithproteinsofinterest,bi鄄otinylatedproximalendogenousproteinsandbiotinylatedproteinscanbeselectivelyisolatedandcandidateinteractionsoftargetpro鄄methodsincludeyeasttwo-hybridandtandemaffinitypurification,butthesemethodshavesomelimitationsandaredifficulttobeap鄄(BioID)isauniquemethodforweaklyinteractingproteins,andalsograduallyappliedtothepathogenesisoftumorsandotherdiseasesaswellasdrugtargetscreen鄄paper,thistechniqueissummarizedindetail,ds:BioID;adjacentproteinmarkers;pasbeensuccessfullyappliedtothestudyofinsolubleproteinsandtransientor前言在生命体中，蛋白质是发挥作用的主体。细胞中各种复杂的生理活动以及细胞对外部环境的反应均基于蛋白质之间的相互作用，从而形成复杂的信号转导网络。蛋白（PPI）质相互作用包括形成比较稳定的蛋白质复合物或瞬时相互作用，一些蛋白质之间的瞬时相互作用往往具有重细胞周期进程或组织类型而改变，并且可能受到如翻译后弱相互作用和受多因素调节等特点[1]。目前已开发了许多3]方法以研究PPI，例如酵母双杂交和串联亲和纯化等[2，。对杂交系统也存在着高假阳性率和阴性结果[2]。通过修饰酶进行邻近标记是一种新的PPI筛选方法，可以实现对瞬时和弱相互作用的检测。将修饰酶与感兴趣的蛋白质进行融合，修饰酶就能对目的蛋白附近及潜在相互作用的蛋白质进行标记。此类技术的实例包括使用辣根（HRP，过氧化物酶horseradishperoxidase），抗坏血酸过氧（BioID）赖生物素标记的选择性蛋白质组邻近标记[4]。BioID用于鉴定瞬时性、弱相互作用、不溶性细胞结构以及机体内动态过程。本文主要对BioID邻近依赖生物素鉴定进行总结归纳，阐述了其原理和方法及其在肿瘤疾病中蛋白相互作用鉴定的应用。1BioID技术的策略（APEX，engineeredascorbateperoxidase）和邻近依要的生理功能。PPI大多是一种动态的过程，会随着时间、化物酶适修饰，蛋白质的构象变化等许多因素的影响，具有瞬时性、技术相比传统的蛋白相互作用发现方法具有显著优势，于稳定的PPI，依赖于亲和纯化的生物化学方法可靠并被广泛使用，串联亲和纯化使用两个标签经过两步连续的亲和纯化，提高了纯化产物的特异性，但缺点是有些瞬时性及弱相互作用难以检测到[3]。基于PPI亲和力，还开发了一些高通量筛选方法，最广泛使用的酵母双杂交系统可用于鉴定给定靶蛋白的候选相互作用配体。这种基于酵母的方法也已经升级以适应哺乳动物细胞中的应用，然而酵母双质，并将其应用在分泌蛋白或膜结合蛋白上。BirA属于生2001年，Parrott等人[5]提出BirA可用于生物素化蛋白（BirA）1.1生物素连接酶物素连接酶的一种，来源于大肠杆菌，大小约为35.5kDa，作者简介：王晓飞（1994-），男，硕士研究生，研究方向：肿瘤信号通路。（1979-）研究方向：肿瘤信号通路。*通讯作者：丁明，男，博士，特聘研究员，-164-

2020年13期TechnologyInnovationandApplication科技创新与应用技术创新包含三个结构域：N-末端DNA结合结构域，中心催化结构域和C-末端结构域，其中心催化结构域负责结合ATP并BirA与靶蛋白GATA-1的体相（内互红生物作用[6]系特素异化。核，利deBoer蛋白用转录BirA等人[7]因子检测首）相到次互了成作能功用与应用的目标了分子蛋白基于而找到其潜在的分子靶点。2004年，Choi-Rhee等人[8]对生，从物素连接酶BirA进行突变研究，通过筛选得到一种BirABirA的突变的体突变BirA*体（BirA*R118G（R118G）。2012）在年细，胞Roux内标等人[6]记相互将这作用种蛋白利用的方法称为BioID。该一系列的工作奠定了将BirA蛋白用于邻1.2近相BioID互作用的坚技术定的工作基础。质，BioID野生型通BirA过生物仅素原能连理标接记酶一个BirA蛋白来，筛BioID选生利理相关用大的肠蛋白BirA*（杆菌BirAR118G生物）的素突化变形是一式个两，促步反进近应端，蛋白先是的生物BirA催素化化[6]。野生型生物素和ATP生成活化的biotinoyl-5'-AMP中间体，并将其保持在自身的活性位点上，即中心催化结构域上；随后与靶蛋白上的特定赖氨酸反应，在生物素和赖氨酸侧链之间形成酰胺键，形成生物素化的靶蛋白，释放出AMP。BirA需要特异性识别一段15个氨基酸的序列来生物素化目的蛋白，这样的要求大大减少了潜在的目标蛋白质的数量。相反，BirA的突BirA变形放，从高式而，对BirA*导致biotinoyl-5'-AMP，在活性位点携活化的biotinoyl-5'-AMP的带亲R118G和力显突变，且活性比脱离著催降化低中并心提，前非释特异rA*性地与邻近蛋白质上的伯胺进行共价结合，即突变的Bi化[9，10]不。需但要BirA*识别特的定标的记氨半基径酸仅也为能10nm使其周左右围，的在分目子的生物蛋白附素原近10nm范围内的蛋白都会被生物素化而被鉴定出来。因此只能对邻近蛋白质实现非特异性的标记，需要谨慎解释阴性结果，因为在分析中可能遗漏了一些已知的相互作用伴侣[11]。在2016年，Kim和Roux等人[12]对BioID进行了改进，提出了BioID2，基于来自超嗜热菌（us）的BirAR40G），缺乏DNA结合结构域，分子量更小（27kDa），有利于准确定位融合蛋白及与靶蛋白结合，且需要加入的生BioID物素少此能够相于检测比第，到BioID2一代BioID第一代的生物，生连接酶素物难化素以范围化生物和标素效记化率效的显率蛋白著更质增高[12]强。。，因与1.3载体BioIDBioID中生成和分析的表过技术征程可分流程BioID为：融（1合）在蛋白哺乳以动物稳定（表达细或其它）胞表达系；2）使用该细胞系用于大规模BioIDpulldown并通过质谱鉴定蛋白质候选物。BioID技术的操作主要包括以下流程：（1）构建BioID融合蛋白的表达载体，稳定表达融合素BirA化目的的目蛋白附的蛋白近的；（2）蛋白在特；定（3条件）提下取添总加蛋白生物并将素诱其导与，链霉生物Western-blot亲和素磁珠结进行鉴定以合[13]及孵。质育谱，分富析集的被方生物法，对素化富的集蛋白到的生物；（4）素利化用蛋白2作用BioIDBioID，而蛋白技术通在肿瘤蛋白质组学相互过作用BirA*在肿瘤形成中的等融疾合应用病蛋白的发生来鉴过定程蛋白中也相是互时刻存在的，利用BioID技术对肿瘤发生过程中的蛋白进行标记，再结合高分辨质谱技术，就有可能找到相关的靶点蛋白，解释肿瘤发生的机制。因此，BioID技术逐渐被应用于肿瘤单体Ras机GTP蛋白制的结合是研究蛋白Ras及，具基药有因物表达靶点GTPase产物，的筛选活性分。。子野量生为型21kDaRas受，属到机于体严格的调控，其与GTP结合时为活性状态，而与GDP结合时为非活性状态，形成一种动态平衡，但平衡会被Ras的突变所打破。在大约三分之一的人类癌症中发现了三种主要Ras亚型HRAS、NRAS和KRAS的突变，但由于Ras的结构和复杂的调控机制，靶向治疗仍然是一个挑战[14]。以往的蛋白质组学分析受到实验工具的限制，无法捕捉Ras在BioID细胞中相互作用的动态过程及瞬态性质。Kovalski等人[15]将长所需技术的Ras与CRISPR近端蛋白筛质选。相该结实合验，鉴对定野生Ras型依Ras赖癌蛋白细胞和生三种突变型Ras蛋白均进行了BioID实验，将BirA*与野生型Ras蛋白及三种突变型Ras蛋白融合，通过质谱分析鉴定出了690个Ras近端蛋白，其中150个蛋白在3种Ras突变型中均存在，进而确定了活性Ras和mTOR复合物2mTORC2）之间的相互作用，活性Ras能刺激mTORC2激酶活性。Ras-mTORC2相互作用激活下游促增殖转录程序，促进Ras依赖性肿瘤在体内的生长。正常B细胞发育所必需的转录因子经常在B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中发生突变，其中突变频繁的蛋白质包括转录因子PAX5，这些突变通常导致转录因子功能的部分丧失。虽然PAX5的功能与人类恶性肿瘤有明显的B细关胞系祖，但细是胞没的发有足育够和的功证能据表明影响，PAX5的因杂此合PAX5子缺失可能对是B-ALL靶向的转录因子有显网著络的一个组成部分[16]。用OkuyamaBioID技术等[17]为了研究与PAX5相关的功能网络，他们使在活细胞中分离与该转录因子相关的蛋白质Abelson，将生物出239种病素蛋白毒连转接酶BirA*与PAX5融合，融合蛋白在小鼠质化，的其Pre-B中几种细蛋白胞系在中人表达类B-ALL，通过质中发生谱鉴定了突变，包括IKZF1和RUNX1，通过BioID与ChIP-Seq两种方法的应用证明了PAX5是淋巴白血病靶向功能性转录因子网络的一部分，经常被B-ALL中的多个突变所靶向，-165-（（（

技术创新TechnologyInnovationandApplication科技创新与应用2020年13期从而揭示白血病细胞中的分子相互作用。作为去泛素酶，泛素羧基端水解酶UCH-L1属于UCH亚家族，主要在脑组织中表达，在其他组织中的表达水平较低，但在一些癌症中发现了UCH-L1的过度表达，比如骨髓瘤、前列腺癌及神经母细胞瘤等[18]。然而，UCH-L1在乳UCH-L1腺癌侵袭中的作用尚不清研究发现高。虽然异在位具有UCH-L1更高侵表达入能未力楚能的。改癌Luo变细胞YMCF-7中等人[19]表达（人水乳平腺显癌著）增细胞中的细胞增殖，但它引起细胞侵袭的能力显著上调。此外MCF-7，siRNA制，Luo细Y胞介等人通的导侵的袭抑UCH过BioID制。-L1为技术将了研究这些敲低导致BirA*观察UCH与结-L1UCH-L1果的过分表子达蛋白机的N-末端融合，形成融合蛋白BirA*-UCH-L1，然后，我们在MCF-7细胞中表达了BirA*-UCH-L1，通过质谱鉴定显示UCH-L1可以与MCF-7细胞中的Akt相互作用。用His标down记的重组UCH-L1蛋白和活化。实该验实进一验证步证明明UCH-L1UCH-L1MCF-7的过表达优先结细导合胞致Akt2裂解Akt用于液进行的激Aktpull活，的也表明UCH-L1能促进乳腺癌细胞的侵袭，因此可以作为治疗乳腺癌的潜在治疗靶标。肺癌是导致全球癌症死亡的主要因素之一，鳞状细胞SQCC癌（SQCC被认）是为肺癌起源中于比支较常气管见基，底细属于胞非小，通细过胞吸烟肺癌引的一起的种损。伤反应导致该干细胞群体发生增生性鳞状病变。经实验统计证明，在94豫的SQCC中3q26-28区域中SOX2的拷贝数增加，并通过稳定干细胞的初始鳞状损伤反应和促进浸润SOX2性癌BioID靶的生长在向策略可疾以病进展的早期和晚期起作用[20]。因此抗间接干技术扰SOX2表征体活内帮性的新SOX2助治疗策的鳞略。相状该互细方案作胞用癌，Kim等人[21]使用确组定，了以82期找个出高能丰够度SOX2的SOX2互动蛋白，随后在基底细胞和SQCC中都验证了于基底细与共胞激中的活因子SOX2EP300活性是的相互必作需用的，，EP300证明了拷贝EP300数对SQCC在癌的潜中也是增加的，因此EP300可以作为治疗鳞状细胞3在自结束语治疗靶标。BioID技术问世以来，其在PPI的鉴定中广泛应用，也为肿瘤等疾病机制的研究和药物靶点的发现提供了一种新的方法。BioID的优势在于它能够识别与目标蛋白质间接或弱相互作用的蛋白质，实现蛋白质相互作用中动态过程及瞬时相互作用的鉴定。重要的是，这种方法的应用非常简单，输出信息丰富。但BioID技术也存在一些不足：1）在BirA*的标记范围内，位于目的蛋白附近的蛋白质都会被生物素化而被鉴定出来，这是一种非特异性的标记，可能会产生阴性结果，某些候选蛋白与目的蛋白之间-166-并不存在相互作用；（2）通过BioID和质谱方法鉴定出的候选蛋白的丰度不能代表候选蛋白与目的蛋白生物相关性的强弱；（3）BirA*本身具有一定的尺寸大小，可能会影响一Munter些分子质量较少的目的蛋白的功能及个片段，等人定位。2017年[22]提出了Split-BioID，该方法将BirA*分成两N端的BirA*和C端的BirA*，它们单独存在时并不能发挥功能，但将N-BirA*和C-BirA*分别与两个目的N-BirA*蛋白融合而可以特和，当异性C-BirA*这两个地标记目才融的能合蛋白蛋白形成有质因复合功为物的能相的互相完作互整用作的而用BirA*靠近蛋白。，时从，该方法将蛋白质片段互补技术与BirA*邻近标记技术结合，有效解决了BioID非特异性标记的问题。2018年Stewart等人[23]开发了一种新型的双组分BioID技术（2C-BioID）用于鉴定蛋白质的相互作用，先将生物素蛋白连接酶与目标蛋白分开表达，然后通过添加诱导二聚化试剂诱导二聚化形成BirA*与目标蛋白的复合体，达到标记邻近相互作用蛋白的目的。在该方法中，将未诱导聚合样品同样进行蛋白质组学分析，作为整个方案的对照组，来消除假阳性率，提高BirA*标记的特异性。随着BioID技术不断的改进与优化，BioID技术将广泛应用于蛋白质相互作用的鉴定、肿瘤机制的研究及药物靶点的筛选中。参考文献院[1]NgounouvestigationofWetiestableAGand，SokolowskatransientproteinI，Woods-proteinAG，原Past：557.，present，andfuture[J].Proteomics，2013，13（3-4）：538-[2]MehlasystemJ，Spring：atoolCaufieldformappingJH，Uetzprotein-proteinP，eractionsyeasttwo-hybrid[3]PuigHarborPurifica-O，protocols，2015：425-430.[J].ColdtionCaspary（TAP）methodF，Rigaut：ageneralG，demAffinityplexpurifica-tion[J].Method，2001，24：eincom原[4]ReesJproteomicsS.，LiXW[J].，.S，n，2015neighbors，14：ity[5]ParrottandcellsurfaceMB，licbiotinylationofsecretedphysResCommun，2001，from281：[J].BiochemBio原[6]RouxligaseinfusionKJ，proteinKimDidentifiesI，RaidaproximalM，teractingpromiscuousproteinsbiotin[7]demammaliantionandBoersingle-stepE，cells[J].rificationP，BonteBiol.，2012，196：edE，riptionEfficientbiotinylafactorsin原渊下转170页冤（

应用科技TechnologyInnovationandApplication科技创新与应用2020年13期根据运行监测信号，系统自动计算得出故障类型X1、（按照高中低三个超限预警值X2、X3、X4、X5、X6风险等级计算而来）。2.4支吊架检验与调整根据风险提示，开展针对性的支吊架检查。检查结果如表5所示。针对故障情况，开展调整工作。调整项如表6所示。3结束语风险评估技术是针对高温蒸汽管道进行潜在故障类型进行分类，收集资料建立模型开展正常工作工况下应力、振动及热位移分析，再结合在线状态监测系统分析运行中的管道系统状态的风险预警点，然后开展有针对性的支吊架检验与调整工作。这一技术解决了支吊架检验过程中的过量检修、检修不足、检修无针对性等问题，经济高效，且为电力行业提供了一套高温金属管道状态实时监控系统，具有很强的推广价值。参考文献院王军民，等.大口径高温高压管道下沉分析[J].工[2]程勇明，马红，仇云林，等.主蒸汽管道下沉原因分析及治理[J].[3]余成长，唐璐，广东电力，2010，23（7）：69-71.术，2019，3：7-8.[4]欧国鑫.主蒸汽管道沉降故障分析及整治[J].特种设备安全技[5]王富楼.邹县电厂5号机组主汽管严重位移分析与研究[D].河北业安全与环保，2016，42（9）：58-60.电力出版社，2013：78-93.保定：华北电力大学，2004：3-10.[6]童良怀，刘震杰，蒋文焕.热电锅炉主蒸汽管道安全状况分析与于涛.低温再热蒸汽管道下沉原因分析及处理措[7]王光林，马强，魏江，等.主蒸汽管道恒力弹簧吊架应力分析与[8]魏红明，范佩佩，疲劳寿命预估[J].发电设备，2019，33（6）：381-385.施[J].中国高新技术企业，2016，18：360-370.应对[J].工业锅炉备，2018，3：42-44.[9]电力行业金属材料标准化技术委员会.火力发电厂管道支吊架验收规程：DL/T1113-2009[S].北京：中国电力出版社，2009.[10]沈观林.应变电测技术新发展及在反应堆结构等工程中的应用[J].原子能科学技术，2008，8（42）：681-683.中国[1]西安热工研究院.发电设备状态监测与寿命管理[M].北京：渊上接166页冤mammaliancellsandtransgenicmice[J].ProcNatlAcadSciUS[8]Choi-RheeE，SchulmanH，cuousproteinbiotinylationbyEscherichiacolibiotinproteinligase[J].ProteinSci.2004，13：3043-3050.A，2003，100：7480-7485.[16]SmeenkL，FischerM，JuradoS，larroleofphoblasticleukemia[J].EMBOJ.2017，36（6）：onal[18]ktargetedthePAX5-ETV6oncoproteininpromotingB-cellacutelym原[17]OkuyamaK，StridT，KuruvillaJ，5ispartofaleukemia[J].PLoSGenet.2019，15（8）：，inholoenzymesynthetases[J].ProteinSci.2000，9：1530-[9]KwonK，onofaconservedsequencemotif90：kerandubiquitinsystemprotein[J].ProgNeurobiol，2010，UCHL1（PGP9.5）：neuronal[10]KimDI，gtheVoid：Proximity-BasedLa原（11）：ofProteinsinLivingCells[J].TrendsCellBiol，2016，26[19]LuoY，HeJ，YangC，-L1promotesinvasionofbreastcancercellsthroughactivatingAktsignalingpathway[J].JCellBiochem，2018Jan，119（1）：691-700.[11]LiP，LiJ，WangL，ityLabelingofInteractingteomics，2017，17（20），1700002.[20]HammermanPS，LawrenceMS，VoetD，原hensivegenomiccharacterizationofsquamouscelllungcancers[J].Nature，2012，489：ns：ApplicationofBioIDasaDiscoveryTool[J].Pro原[12]KimDI，JensenSC，NobleKA，ovedsmallerbiotinligaseforBioIDproximitylabeling[J].MolBiolCell，2016，27：1188-1196.[21]KimBR，CoyaudE，MoghalN，ficationoftheSOX2InteractomebyBioIDRevealsEP300asaMediatorofSOX2-dependentSquamousDifferentiationandLungSquamous2017，16（10）：n-protein[13]RouxKJ，KimDI，BurkeB，：ascreenfor2018，91，ctions[J].CurrProtocProteinCellCarcinomaGrowth[J].Molecular&CellularProteomics，Sci.[22]DeMunterS，GornemannJ，DeruaR，-BioID：aproximitybiotinylationassayfordimerization-dependentproteininteractions[J].FEBSLetters，2017，591（2）：415-424.[14]StephenAG，EspositoD，BagniRK，原gingrasbackinthering[J].CancerCell.2014，25：272-81.[15]KovalskiJR，ShandersonRL，ctionalfector[J].Oncotarget.2019，10（50）：ityproteomicsestablishesmTORC2asnewdirectrasef原AnadvancedtwocomponentBioIDsystemforprecisionmappingofproteininteractomes[J].iScience，2018，10：40-52.[23]StewartCL,ChojnowskiA,SobotaRM,etal.2C-BioID：-170-